加工方式對(duì)羊乳表皮生長(zhǎng)因子(EGF)濃度的影響

雷飛艷，云丹，王畢妮，邵玉宇，張富新

(陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安，710119)

加工方式對(duì)羊乳表皮生長(zhǎng)因子(EGF)濃度的影響

雷飛艷，云丹，王畢妮，邵玉宇，張富新*

(陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安，710119)

研究加工方式對(duì)羊乳中表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)濃度的影響。其中主要通過(guò)均質(zhì)、殺菌條件、攪拌、乳酸菌發(fā)酵以及貯存條件對(duì)乳中EGF濃度的影響。研究結(jié)果表明，均質(zhì)過(guò)程對(duì)羊乳中EGF濃度幾乎無(wú)影響(P>0.05)；隨著攪拌時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)，低速時(shí)使EGF濃度先增加后減少，高速時(shí)使EGF濃度漸漸減少；羊乳在高溫短時(shí)巴氏殺菌(75 ℃/15 s，85 ℃/10 s)時(shí)其中的EGF濃度較為穩(wěn)定，保留率達(dá)到90 %以上，而在低溫長(zhǎng)時(shí)巴氏殺菌(63 ℃/30 min)和超高溫瞬時(shí)殺菌(137 ℃/2 s)EGF濃度顯著降低；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乳中EGF濃度逐漸降低，在冷藏過(guò)程中EGF濃度無(wú)顯著性變化；隨著貯存時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)，EGF在強(qiáng)化生鮮羊乳和全脂羊奶粉中都具有良好的穩(wěn)定性。

羊乳；酶聯(lián)免疫；表皮生長(zhǎng)因子；加工方式

羊乳被譽(yù)為“乳中之王”，其中富含有蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素、脂肪、膽固醇和多種生物活性物質(zhì)[1-2]。羊乳營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，具有潤(rùn)心肺、利大腸、補(bǔ)腎益精、滋陰養(yǎng)胃、治消渴、食療的功能，在西方國(guó)家被作為療效食品[3]。除此之外，羊乳中還有一定量的EGF，EGF對(duì)于后代的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的作用，EGF不僅可以刺激多種細(xì)胞的增殖，主要是表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，可用于眼角膜的損傷、燒燙傷及手術(shù)等創(chuàng)面的修復(fù)和愈合，而且對(duì)于美容養(yǎng)顏具有很大的功效。目前，有關(guān)乳中的EGF研究報(bào)道很少，尤其是羊乳中更是研究甚少。因此，本文較為系統(tǒng)地研究加工方式均質(zhì)、攪拌、殺菌條件、發(fā)酵及貯存對(duì)于羊乳中EGF濃度的影響。以便為在加工方式中保護(hù)羊乳中EGF奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

羊乳，來(lái)自于陜西省楊凌和富平縣奶山羊羊場(chǎng)；試劑盒(山羊表皮生長(zhǎng)因子酶聯(lián)免疫試劑盒)，來(lái)自美國(guó)R&D公司；EGF標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)R&D 公司。

1.2 主要儀器

MDF-U5411型低溫冰箱，日本三洋電機(jī)有限公司；智能生化培養(yǎng)箱，寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限廠；TGL-16B型高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；Multiskan Go型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)熱電公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；JJ-006/60均質(zhì)機(jī)，廊坊通用機(jī)械有限公司；XMTD型數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 均質(zhì)對(duì)EGF濃度的影響

取200 mL奶樣，在室溫條件下，均質(zhì)壓力分別為0、10、20、30、40、50 MPa，均質(zhì)10 min后測(cè)定均質(zhì)前后羊奶中EGF濃度變化。

1.3.2 攪拌對(duì)EGF濃度的影響

量取50 mL乳樣于100 mL的燒杯中，在室溫環(huán)境下，分別在低速800 r/min和高速3 500 r/min兩個(gè)不同轉(zhuǎn)速下攪拌5、10、15、20 min，以未攪拌處理乳樣作為空白對(duì)照，測(cè)定其EGF含量。

1.3.3 殺菌方式對(duì)EGF濃度的影響

將乳樣分別加到毛細(xì)管中，加熱將毛細(xì)管兩端封口，放到油浴中后分別在63 ℃/30 min(巴氏長(zhǎng)時(shí)殺菌)、75 ℃/15 s(巴氏短時(shí)殺菌)、85 ℃/10 s(巴氏短時(shí)殺菌)、137 ℃/2 s(超高溫瞬時(shí)殺菌)加熱后，立即取出毛細(xì)管并置于冷水浴中冷卻，以未殺菌處理乳樣作為空白對(duì)照，測(cè)定其EGF含量。

1.3.4 發(fā)酵對(duì)EGF濃度的影響

(1) 粗提物EGF的制備：將乳樣在6 000 g、4 ℃離心8 min，倒掉上層乳脂肪和下層酪蛋白沉淀，收集中層乳清，置于玻璃平板上，用報(bào)紙封口，并放在-40 ℃冰箱中冷凍12 h，然后進(jìn)行冷凍干燥24 h，得到粗提物。

(2) 發(fā)酵劑的活化：將24 g的脫脂羊奶粉置于176 mL的水中，制成12%的羊乳脫脂復(fù)原乳，然后在121 ℃滅菌20 min，迅速冷卻至43 ℃，然后加2%的發(fā)酵劑，混勻后在置于43 ℃培養(yǎng)箱4 h，得活化的發(fā)酵劑。

(3) 羊乳的發(fā)酵：將EGF的粗取物按照10%比例添加至鮮羊乳中，然后在80 ℃條件下滅菌20 min，冷卻至43 ℃，再按照體積分?jǐn)?shù)2%的比例添加已活化了的發(fā)酵劑，置于43 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵至凝固狀態(tài)，然后在5 ℃條件下貯存24 h進(jìn)行后發(fā)酵，最后置于4 ℃的冰箱中保存。分別測(cè)定原料乳、發(fā)酵后，后發(fā)酵4、8、12、16、20 d時(shí)EGF濃度，然后計(jì)算出EGF的活性保留率。

1.3.5 貯存對(duì)EGF濃度的影響

(1)將粗提取的EGF加至滅菌的羊乳中(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%)，混勻得到EGF強(qiáng)化羊乳，4 ℃條件下貯存12 d，然后分別在第0、4、8、12 d測(cè)定乳中EGF濃度。

(2)將粗提取的EGF加至全脂羊奶粉中(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%)，混勻得到EGF強(qiáng)化全脂羊奶粉，25 ℃條件下貯存4周，然后分別在第1、2、3、4周測(cè)定其中EGF濃度。

1.3.6 EGF濃度的測(cè)定

(1)樣品處理

按照OSLISLO[3]的方法處理并稍加改進(jìn)。乳樣解凍后，吸取0.5 mL羊乳置于2 mL離心管中，接著在3 000 g下離心15 min，去除上層脂肪和下層沉淀，取中間乳清部分，用ELISA試劑盒測(cè)定EGF濃度。

(2)EGF濃度的檢測(cè)

EGF濃度采用酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒測(cè)定。將EGF試劑盒在室溫(20 ℃)平衡20 min，取出其中的板條。取10 μL處理后的樣品加入板條反應(yīng)孔中，接著加樣品稀釋液40 μL，隨后加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體50 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔后，在37 ℃保溫60 min。棄去反應(yīng)孔中液體，在濾紙上拍干，加入預(yù)先稀釋好的洗滌液350 μL，放置1 min，棄去洗滌液，拍干，如此操作重復(fù)5次。在洗滌后的反應(yīng)孔中加入A、B底物各50 μL，37 ℃保溫15 min后在反應(yīng)孔中加入終止液50 μL，15 min內(nèi)在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定各孔的吸光度值。每個(gè)樣品做3次平行。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用酶聯(lián)免疫試劑盒方法檢測(cè)不同濃度EGF標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，然后以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X)，對(duì)應(yīng)吸光度值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制EGF標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算線性回歸方程，按回歸方程計(jì)算各樣品EGF濃度。計(jì)算線性回歸方程，按照線性回歸方程計(jì)算不同樣品中的EGF濃度。線性回歸方程為y=0.001 87x+0.081 8，R2=0.999 13。

(4) 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果及分析

2.1 均質(zhì)對(duì)EGF濃度的影響

取200 mL奶樣，在室溫條件下，均質(zhì)壓力分別為0、10、20、30、40、50 MPa，均質(zhì)10 min后測(cè)定均質(zhì)前后羊奶中EGF濃度變化。結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。

圖1 均質(zhì)壓力對(duì)羊乳巾EGF濃的影響Fig.1 Effects of homogenaging pressure on the concentrations of EGF in goat milk

從圖1和表1可以看出，均質(zhì)前， EGF的濃度為(50.73±1.01)ng/mL，在均質(zhì)壓力為0、10、20、30、40、50 MPa均質(zhì)時(shí)的保留率分別為91.19%、94.74%、92.80%、95.58%、97.90%，其保留率均在90%以上，因此均質(zhì)壓力對(duì)EGF的濃度無(wú)顯著性影響(P>0.05)，說(shuō)明羊乳中的EGF對(duì)均質(zhì)壓力具有較高的穩(wěn)定性。

在乳制品加工中均質(zhì)是很常用的一種處理方式，它可使乳中脂肪粒變小，從而提高乳的穩(wěn)定性。一方面，均質(zhì)可以使乳脂肪球膜上的EGF脫離，從而使EGF濃度升高，同時(shí)影響著蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，破壞了維持蛋白質(zhì)的非共價(jià)鍵和疏水作用，從而使得蛋白質(zhì)發(fā)生變性。另一方面，EGF是蛋白質(zhì)，主要由非共價(jià)鍵維持著其活性中心，這種非共價(jià)鍵在壓力條件下表現(xiàn)的比較敏感，均質(zhì)過(guò)程中使得其中的離子鍵和疏水作用被破壞，從而使得蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子間產(chǎn)生更多的氫鍵，使蛋白質(zhì)球狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部氨基酸側(cè)鏈外露[4]，使活性中心結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而使得EGF的活性降低[5]。此外，在均質(zhì)壓力下，乳的流速逐漸增大，并且伴隨著撞擊、空穴等作用，使得EGF的構(gòu)象和活性中心發(fā)生改變，從而使其中的生物活性失去或鈍化；加上均質(zhì)過(guò)程中由于較高的流體速度引起的摩擦使乳溫度上升[6]，這些都會(huì)引起EGF變性，從而使EGF活性降低。

表1 均質(zhì)壓力對(duì)羊乳EGF濃的影響

2.2 攪拌對(duì)EGF濃度的影響

取50 mL奶樣于100 mL的燒杯中，在室溫條件下，分別在低速800 r/min和高速3 500 r/min兩個(gè)不同轉(zhuǎn)速下攪拌5、10、15、20 min，測(cè)定其EGF濃度。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 攪拌對(duì)羊乳中EGF濃度的影響Fig.2 Effect of agitation on the concentrations of EGF in goat mild

由圖2可以看出，攪拌對(duì)EGF濃度有所影響。在較低速度800 r/min下攪拌時(shí)，隨著攪拌時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)，EGF的濃度呈現(xiàn)的趨勢(shì)是先增加后減少。尤其是在5 min時(shí)，EGF濃度達(dá)到最大，由剛開(kāi)始的(50.73±1.01) ng/mL上升到(55.63±1.05) ng/mL，與原料乳樣的EGF濃度相比有顯著性差異(P<0.05)；從5 min以后，隨攪拌時(shí)間的延長(zhǎng)，羊乳中EGF濃度呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)。在較高速度3 500 r/min下攪拌時(shí)，隨著攪拌時(shí)間的延長(zhǎng)，EGF濃度呈現(xiàn)的趨勢(shì)是逐漸減小。從圖中可以看出，高速攪拌比低速攪拌時(shí)EGF濃度下降速度更快，因此可以說(shuō)明，高速攪拌比低速攪拌對(duì)乳中EGF濃度影響更大。

乳腺細(xì)胞合成并且分泌EGF的主要途徑是通過(guò)合成為乳脂肪膜結(jié)合性的EGF，且低速短時(shí)地進(jìn)行攪拌會(huì)使乳中EGF活性被激活，由于攪拌可能會(huì)影響脂肪球膜和EGF的物理狀態(tài)，在攪拌速度很低的情況下，脂肪球膜與EGF會(huì)發(fā)生分離，從而使更多的EGF被釋放出來(lái)。但是如果進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的攪拌或者過(guò)快攪拌時(shí)，這樣會(huì)導(dǎo)致乳溫升高[7]，從而EGF的結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞[8]，李建華[9]通過(guò)研究護(hù)膚品配方對(duì)EGF的影響，結(jié)果表明溫度升高會(huì)使EGF的的活性降低。

2.3 殺菌方式對(duì)EGF濃度的影響

將預(yù)處理后的奶樣加入毛細(xì)管中，在酒精燈上加熱并將兩端封口，置于油浴中分別在63℃/30 min(巴氏長(zhǎng)時(shí)殺菌)、75℃/15 s(巴氏短時(shí)殺菌)、85℃/10 s(巴氏短時(shí)殺菌)、137℃/2 s(超高溫瞬時(shí)殺菌)加熱后，取出毛細(xì)管并立即置于冰浴中冷卻，測(cè)定EGF濃度并計(jì)算其活性保留率。結(jié)果見(jiàn)圖3和表2。

圖3 殺菌條件對(duì)羊乳中EGF濃度的影響Fig.3 Effect of sterilintion condition on the concentrations of EGF in goat milk

表2 殺菌條件對(duì)羊乳中EGF濃度的影響

由圖3和表2可以看出，殺菌條件對(duì)EGF濃度有所影響。從中可以看出，EGF的保留率均在90%以上，表明巴氏短時(shí)殺菌對(duì)EGF濃度無(wú)顯著性影響(P>0.05)；在巴氏長(zhǎng)時(shí)殺菌和超高溫短時(shí)殺菌時(shí)， EGF保留率顯著低于巴氏短時(shí)殺菌(P<0.05)。由此可以說(shuō)明巴氏短時(shí)殺菌可以更大限度保留乳中的EGF，而巴氏長(zhǎng)時(shí)殺菌和高溫短時(shí)殺菌可能會(huì)引起EGF結(jié)構(gòu)發(fā)生相應(yīng)的改變，從而使EGF部分失活。

YAGI[10]等對(duì)鮮牛乳進(jìn)行巴氏殺菌后檢測(cè)出其中的EGF損失率達(dá)到了50%左右；關(guān)榮發(fā)[11]等對(duì)乳進(jìn)行熱處理研究其對(duì)EGF的影響，發(fā)現(xiàn)原料乳中的EGF濃度達(dá)到最高，其次是巴氏殺菌乳、(超高溫瞬時(shí)滅菌)UHT乳、國(guó)外嬰幼兒配方奶粉，由此可以說(shuō)明熱處理對(duì)乳中EGF濃度有一定的影響。

2.4 發(fā)酵對(duì)EGF濃度的影響

通過(guò)由羊乳制備的酸羊奶，分別測(cè)定羊乳發(fā)酵前、發(fā)酵后，后發(fā)酵4、8、12、16、20 d時(shí)乳中EGF濃度變化，然后計(jì)算出乳中EGF的保留率。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 發(fā)酵對(duì)羊乳中EGF濃度的影響Fig.4 Effect of fermentation on the concentrations of EGF in goat mild

從圖4可以看出，發(fā)酵對(duì)EGF活性影響比較大。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，EGF的濃度和保留率下降趨勢(shì)比較大。發(fā)酵后乳中的EGF的保留率是64.80%，減少了接近35%；從剛開(kāi)始發(fā)酵到冷藏8 d這段時(shí)間內(nèi)，EGF的保留率達(dá)到顯著性降低(P<0.05)，從冷藏第8 d到冷藏第20 d的這段時(shí)間，羊乳中EGF濃度表現(xiàn)出無(wú)顯著性差異(P>0.05)，尤其是冷藏第20 d時(shí)EGF的保留率為34.80%，減少了接近65%。因此可以總結(jié)出，發(fā)酵期間和冷藏初期時(shí)EGF濃度下降比較快，但在冷藏4 d后乳中EGF的濃度是比較穩(wěn)定的。

羊乳在發(fā)酵過(guò)程中pH值會(huì)有相應(yīng)的改變，一方面，EGF可以作為乳酸菌生長(zhǎng)繁殖所需的營(yíng)養(yǎng)成分氮源而被利用，使得乳酸菌能夠繼續(xù)生長(zhǎng)，另一方面，可能是由于乳酸菌生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的某些代謝產(chǎn)物(如蛋白酶)可以導(dǎo)致EGF發(fā)生分解，因此發(fā)酵乳中EGF含量會(huì)相應(yīng)的降低[12-13]。

2.5 貯存條件對(duì)EGF濃度的影響

用粗提取的EGF分別制備強(qiáng)化生鮮羊乳和強(qiáng)化全脂羊奶粉，測(cè)定其在貯存期間EGF濃度變化，結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。

圖5 EGF強(qiáng)化鮮羊乳的貯藏穩(wěn)定性Fig.5 The stability of EGF enhanced raw goat milk during storage(注：貯存條件為4℃)

圖6 EGF強(qiáng)化全脂羊奶粉的貯存穩(wěn)定性Fig.6 The stability of EGF enhanced whole goats' milk powder during storage(注：貯存條件為25℃)

由圖5和圖6可以看出，隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，EGF強(qiáng)化生鮮羊乳和強(qiáng)化全脂羊奶粉都比較穩(wěn)定。KANG[14]等在研究IGF-1強(qiáng)化生鮮牛乳和強(qiáng)化全脂牛奶粉的貯存穩(wěn)定性時(shí)，發(fā)現(xiàn)IGF-1在整個(gè)貯存期間都具有較好的穩(wěn)定性，顯然，EGF和IGF-1都是小分子多肽，在貯存期間其結(jié)構(gòu)基本不會(huì)發(fā)生改變，具有很好的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

研究加工方式對(duì)羊乳中表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)濃度的影響。其中主要通過(guò)均質(zhì)、殺菌條件、攪拌、發(fā)酵和貯存條件對(duì)乳中EGF濃度的影響。研究結(jié)果表明，均質(zhì)過(guò)程對(duì)羊乳中EGF濃度幾乎無(wú)影響(P>0.05)；隨著攪拌時(shí)間的延長(zhǎng)，低速時(shí)使EGF濃度先增加后減少，高速時(shí)使EGF濃度漸漸減少；羊乳在高溫短時(shí)巴氏殺菌(75 ℃/15 s，85 ℃/10 s)時(shí)其中的EGF濃度較為穩(wěn)定，保留率達(dá)到90 %以上，而在低溫長(zhǎng)時(shí)巴氏殺菌(63 ℃/30 min)和超高溫瞬時(shí)殺菌(137 ℃/2 s)EGF濃度顯著降低；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乳中EGF濃度逐漸降低，在冷藏過(guò)程中EGF濃度無(wú)顯著性變化；隨著貯存時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)，EGF在強(qiáng)化鮮羊乳和全脂羊奶粉中都具有良好的穩(wěn)定性。

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The effect of processing methods on the concentrations of EGF in goats'milk

LEI Fei-yan, YUN Dan, WANG Bi-ni, SHAO Yu-yu, ZHANG Fu-xin*

(College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710119, China)

The effect of processing methods on goat milk EGF concentration, including homogeneous ,stirring, sterilization, fermentation by lactic acid bacteria and storage conditions was studied. The results showed that homogeneous had no effect on goat milk EGF concentration; EGF concentrations increased and then decreased by low-speed string, if stirring at high speed, goat milk EGF concentration decreased gradually. High-temperature short-time pasteurization (75℃/15 s and 85℃/10 s) had little effect on EGF concentration in goat milk, retention rate reached more than 90%; but low-temperature, long-time pasteurization (63℃/30 min) and ultra-high temperature sterilization (137℃/2 s) significantly reduced goat milk EGF concentration. Fermentation process influenced goat milk EGF concentrations and caused its decreased rapidly with the fermentation time. EGF concentration had little change during refrigerated storage and are very stable in EGF enhance goat milk and EGF enhance whole goat milk powder.

goat milk; enzyme linked immunosorhent assay(ELISA); epidermal growth factor; processing methods

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703033

碩士研究生(張富新教授為通訊作者,E-mail: fuxinzh@snnu.edu.cn)。

陜西省重大科技成果轉(zhuǎn)化引導(dǎo)專項(xiàng)(2016KTCG01-12)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(GK201603097)；陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項(xiàng)目(2016NY-207)；陜西省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目(2012K02-06)

2016-07-13，改回日期：2016-08-26