海水厭氧氨氧化反應器的啟動及最佳運行工藝摸索

郝建安，張愛君，楊 波，姜天翔，張秀芝，張曉青，張雨山，王 靜

(國家海洋局天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192)

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海水厭氧氨氧化反應器的啟動及最佳運行工藝摸索

郝建安，張愛君，楊 波，姜天翔，張秀芝，張曉青，張雨山，王 靜*

(國家海洋局天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192)

從渤海灣灘涂地區采集泥水樣品，通過厭氧氨氧化反應特異引物對樣品進行PCR擴增，選取可以擴增出特征條帶的樣品構建厭氧氨氧化反應器，容積為18 L。當反應器的水力停留時間從7 d延長到14 d時，反應器啟動成功。反應器穩定運行的最佳條件為：水力停留時間 7～21 d、鹽度 35‰～50‰、進水總氮負荷變化值小于20%、溫度 20～35 ℃、pH值 6～7。

海水；厭氧氨氧化反應器；啟動；運行工藝

厭氧氨氧化(anaerobicammoniaoxidation，anammox)是一種生物介導的脫氮反應，在此反應中，硝酸鹽和銨離子可以直接轉化為氮氣和水[1]。1977年，Broda[2]預測到了厭氧氨氧化反應的存在；1992年，Mulder[3]在GistBrocades公司的厭氧流化床中發現了該反應的存在；1995年，vandeGraaf等[4]通過一系列研究證明了該反應，并隨后證明參與該反應的微生物是自養型細菌。厭氧氨氧化過程可以在不投加電子供體(碳源)的情況下完成脫氮，具有污泥產量低、CO2排放量少、節能等獨特優勢，荷蘭等多個國家已經建立了厭氧氨氧化反應中試或工廠規模反應器[5-7]。

海水利用是解決水資源匱乏的重要手段，許多沿海城市已經采用海水作為市政工程用水(如沖廁、街道灑水等)[8-10]。對于期間產生的污、廢海水的處理常借用淡水的處理方法，但由于海水鹽度較高，影響微生物的活性，因此，處理效率往往較低。伴隨海水利用產業的發展，污、廢海水量將大大增加，如何處理這些廢水，是海水利用產業亟需解決的問題。

作者在此首次研究海水厭氧氨氧化反應器的構建與啟動，并摸索反應器的穩定運行工藝，以期為厭氧氨氧化技術應用于污、廢海水處理奠定基礎。

1 實驗

1.1 泥水樣品采集與篩選

于渤海灣海河入海口處灘涂采集泥水樣品。用美國MOBIO公司的PowerSoil?DNA Isolation Kit試劑盒提取泥水樣品總DNA，用特異引物Amx809F與Amx1066R進行PCR擴增[11]。PCR反應體系(25 μL)：基因組DNA 1.5 μL(80～100 ng)，引物1.0 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，Taq 0.5 μL。反應條件：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃暫停。

1.2 反應器構建

海水厭氧氨氧化反應器如圖1所示，容積為18 L，用黑色膠皮與黑色漆對反應器進行避光處理，反應溫度控制在35 ℃，注滿海水以保證厭氧條件。

進水(mg·L-1)：NH4Cl 3 000，NaNO2600，MgSO4300，KH2PO430，CaCl2136，NaHCO3500；微量元素Ⅰ 1 mL·L-1，微量元素Ⅱ 1 mL·L-1；海水補齊。

微量元素Ⅰ(mg·L-1)：EDTA 5 000，FeSO45 000。

微量元素Ⅱ(mg·L-1)：EDTA 50 000，ZnSO4·7H2O430，CoCl2·6H2O 240，MnCl2·4H2O 990，CuSO4·5H2O250，NaMoO4·2H2O 220，NiCl2·6H2O 190，NaSeO4·10H2O 210，H3BO414。

1.3 反應器最佳運行工藝摸索

圖1 海水厭氧氨氧化反應器Fig.1 Seawater anammox reactor

分別改變水力停留時間(3 d、7 d、14 d、21 d)、鹽度(32‰、35‰、40‰、42‰、50‰)、進水總氮負荷(增加20%、增加10%、減少10%、減少20%)、反應溫度(10 ℃、20 ℃、35 ℃、50 ℃)、反應pH值(5、6、7、8、9)，觀察海水厭氧氨氧化反應器運行參數的變化，以確定最佳的運行工藝。

1.4 檢測方法

氨氮含量參照GB 17378.4-2007中的納氏試劑法測定，亞硝酸鹽含量參照GB/T 12763.4-2007中的萘乙二胺分光光度法測定。

2 結果與討論

2.1 泥水樣品的篩選結果

提取泥水樣品總DNA，用特異引物進行PCR擴增，結果發現，僅部分樣品可以擴增出約200 bp的特異條帶。將該條帶測序結果與GenBank數據庫進行比對，結果見表1。

表1 DNA片段在GenBank中的比對結果

Tab.1 Sequence alignment of DNA fragment in GenBank

由表1可知，該序列與Planctomycete菌株的16S rRNA基因序列相似度很高，說明可以擴增出特異條帶的樣品中很可能含有厭氧氨氧化特征菌屬Planctomycete的菌株。

目前，還未分離到參與厭氧氨氧化反應的微生物純培養物。但是，通過分子生物學手段發現，產生厭氧氨氧化作用的微生物屬于浮霉狀菌目(Planctomycetales)[12]。厭氧氨氧化反應在海洋環境中普遍存在，并且可能是海洋中無機氮更重要的匯[13-15]。本實驗采樣區為渤海灘涂，是沿海大潮高潮位與低潮位之間的潮浸地帶，其環境溶氧濃度較低，同時PCR反應顯示泥水樣品中極有可能存在參與厭氧氨氧化反應的細菌。因此，選擇該泥水樣品構建反應器，以加快厭氧氨氧化反應的啟動。

2.2 海水厭氧氨氧化反應器的啟動

反應器接種從渤海灣灘涂采集的泥水樣品18 L，定期更換培養液，監測出水的氨氮、亞硝基氮含量，結果如圖2所示。

圖2 海水厭氧氨氧化反應器的啟動Fig.2 Startup of seawater anammox reactor

從圖2可以看出，海水厭氧氨氧化反應器的啟動耗時長達5個月，主要分為2個階段。第一個階段，開始約1周時間，由于反應器剛剛建立，出水參數很不穩定，氨氮去除率與亞硝基氮去除率波動較大，沒有規律；緊接著4個月時間，氨氮去除率在50%左右，而亞硝基氮去除率升高至50%以上，有時甚至升高2倍以上，此時反硝化反應占主導地位。第二個階段，水力停留時間由7 d延長到14 d，氨氮去除率達到70%以上，亞硝基氮去除率達到85%以上，且氨氮去除率與亞硝基氮去除率比值約為1∶1.17。繼續監測2個月，發現氨氮去除率、亞硝基氮去除率、氨氮去除率與亞硝基氮去除率比值一直很穩定，且出水pH值一直在6.5左右，反應器中的污泥由黑色變為紅色。文獻報道，厭氧氨氧化反應器的啟動有2個主要特征，一是反應器內污泥變紅，這是由于厭氧氨氧化反應發生后，細胞色素累積所致[16]；二是出水氨氮與亞硝基氮含量同時降低，且去除率比值為1∶1.32[17]。因此，可以確定海水厭氧氨氧化反應器已經啟動。

近年文獻報道的厭氧氨氧化反應器大部分是淡水型反應器和耐鹽型反應器[18-19]。啟動厭氧氨氧化反應器一般采用原位啟動法或人工培養富集法。原位啟動法是將反應器構建在海底，使反應器在自然環境中啟動厭氧氨氧化反應，耗時較長。如Nakajima等[20]發明了一種柱式反應器，將其固定在海底，耗時1年富集厭氧氨氧化細菌，成功啟動厭氧氨氧化反應。人工培養富集法是在構建的反應器中用人工配制的培養基啟動厭氧氨氧化反應，該法依賴于培養基成分與反應條件的控制。如van de Vossenberg等[21]利用一種基于紅海鹽配制的培養基，從瑞典的Gullmar峽灣海底沉積物中富集了Scalindua屬細菌；Kawagoshi等[22]用合成的海水培養基在海洋環境中成功富集了厭氧氨氧化細菌；Kindaichi等[23]用Hiroshima海灣表面沉積物及人工配制的海水培養基在上流柱反應器中富集了厭氧氨氧化細菌。

本實驗選擇人工培養富集法啟動海水厭氧氨氧化反應器。相比報道的海水厭氧氨氧化反應器，本實驗反應器具有更高的效率與更好的穩定性，在環境條件不發生重大改變的情況下，可以穩定運行1年以上，且氨氮去除率超過90%。

2.3 反應器最佳運行工藝的確定

2.3.1 水力停留時間對厭氧氨氧化反應的影響(圖3)

圖3 水力停留時間對厭氧氨氧化反應的影響Fig.3 Effect of hydraulic retention time on anammox reaction

從圖3可以看出，在海水厭氧氨氧化反應器穩定運行后，當水力停留時間為7～21 d時，氨氮去除率一直穩定在95%以上；當水力停留時間為3 d時，氨氮去除率降至85%。這是因為，水力停留時間直接關系到水中污染物與厭氧氨氧化細菌接觸的時間，當水力停留時間過短，水中氨氮來不及被厭氧氨氧化細菌降解，反應效率較低；當水力停留時間延長，水中氨氮與厭氧氨氧化細菌接觸充分，反應效率較高；但水力停留時間過長，水中污染物基本耗盡，反應效率也較低。因此，適宜的水力停留時間為7～21 d。

2.3.2 鹽度對厭氧氨氧化反應的影響(圖4)

圖4 鹽度對厭氧氨氧化反應的影響Fig.4 Effect of salinity on anammox reaction

從圖4可以看出，鹽度過高或過低對厭氧氨氧化反應均有一定影響，其中低鹽度對厭氧氨氧化反應的影響更大些。當鹽度提高到50‰時，反應效率降低值在10%以內；但當鹽度降低至32‰時，反應效率幾乎降低70%。這是因為，一方面鹽度直接影響滲透壓，鹽度的波動使得滲透壓急劇變化，從而導致細胞活性降低，甚至死亡；另一方面，鹽度的波動對生物處理影響很大，對于經過高鹽馴化的厭氧氨氧化細菌，一旦鹽度突然降低，其生物活性會瞬間降低。因此，適宜的鹽度為35‰～50‰。

2.3.3 進水總氮負荷對厭氧氨氧化反應的影響

初始進水總氮負荷：氨氮94.68 mg·L-1，亞硝基氮99.76 mg·L-1。改變進水總氮負荷分別增加20%、增加10%、減少10%、減少20%，考察進水總氮負荷對厭氧氨氧化反應的影響，結果如圖5所示。

圖5 進水總氮負荷對厭氧氨氧化反應的影響Fig.5 Effect of total influent nitrogen loading on anammox reaction

從圖5可以看出，當進水總氮負荷變化值在10%以內時，并未影響厭氧氨氧化反應效率；但當進水總氮負荷變化值達到20%時，反應效率明顯降低。這是因為，氨氮是厭氧氨氧化的反應基質，在適宜的范圍內，濃度越高越有益于反應；但過高的氮濃度對生物有抑制作用，加上亞硝酸鹽對生物的抑制作用，當提高進水總氮負荷時，也就同時提高了進水氨氮與亞硝基氮的量，兩者發生協同抑制作用，導致反應效率降低。因此，進水總氮負荷變化值應小于20%。

2.3.4 溫度對厭氧氨氧化反應的影響(圖6)

圖6 溫度對厭氧氨氧化反應的影響Fig.6 Effect of temperature on anammox reaction

從圖6可以看出，溫度對厭氧氨氧化反應的影響較大。當溫度在20～35 ℃時，厭氧氨氧化反應效率較高。因此，適宜的溫度為20～35 ℃。

在氣候變化較明顯地區應用厭氧氨氧化反應時，應注意溫度變化對反應的沖擊。

2.3.5 pH值對厭氧氨氧化反應的影響(圖7)

圖7 pH值對厭氧氨氧化反應的影響Fig.7 Effect of pH value on anammox reaction

從圖7可以看出，厭氧氨氧化反應的適宜pH值范圍較窄，在pH值為6～7時厭氧氨氧化反應效率較高，氨氮去除率均達到95%以上；當pH值升高到8時，氨氮去除率降低到90%；當pH值升高到9時，氨氮去除率降低到55%以下；當pH值降低到5時，厭氧氨氧化反應馬上停止。因此，適宜的pH值為6～7。

pH值不僅直接影響厭氧氨氧化細菌的生長，還影響厭氧氨氧化細菌基質的有效性。文獻報道[24-26]，厭氧氨氧化反應的適宜pH值范圍為6.0～8.0，本實驗結果與之相符。

3 結論

研究了海水厭氧氨氧化反應器的啟動與穩定運行的最佳工藝。從渤海灣灘涂地區采集泥水樣品，通過特異引物對樣品進行PCR擴增，選取可以擴增出特征條帶的樣品構建厭氧氨氧化反應器，容積為18 L。當水力停留時間從7 d延長到14 d時，反應器啟動成功，耗時5個月，反應器穩定運行的最佳條件為：水力停留時間7～21 d、鹽度 35‰～50‰、進水總氮負荷變化值小于20%、溫度20～35 ℃、pH值6～7。

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Startup of Seawater Anaerobic Ammonia Oxidation Reactor and Optimization on Operation Process

HAO Jian-an,ZHANG Ai-jun,YANG Bo,JIANG Tian-xiang,ZHANG Xiu-zhi,ZHANG Xiao-qing,ZHANG Yu-shan,WANG Jing*

(InstituteofSeawaterDesalinationandMultipurposeUtilization,SOA(Tianjin),Tianjin300192,China)

Throughanaerobicammoniaoxidation(anammox)specificprimers,sludgewatersamplescollectedfromBohaibeachareawereamplifiedbyapolymerasechainreaction(PCR),andthesamplesamplifiedwithfeaturebandswereselectedtobuildananammoxreactorwithvolumeof18L.Reactorstartedsuccessfullywhenthehydraulicretentiontimechangedfrom7dto14d.Theoptimumoperationconditionswereasfollows:hydraulicretentiontimeof7～21d,salinityof35‰～50‰,changevalueoftotalinfluentnitrogenloadinglowerthan20%,temperatureof20～35 ℃,pHvalueof6～7.

seawater;anaerobicammoniaoxidationreactor;startup;operationprocess

海洋公益性行業科研專項資助項目(201305022-5)，中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金資助項目團隊項目(K-JBYWF-2015-T11，K-JBYWF-2016-T9)，中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金資助項目(K-JBYWF-2016-G10)

2016-11-15

郝建安(1981-)，男，天津人，高級工程師，研究方向：微生物學，E-mail：phoenix328@hotmail.com；通訊作者：王靜，正高級工程師，E-mail：13820529296@163.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.04.015

X172

A

1672-5425(2017)04-0063-05

郝建安，張愛君，楊波，等.海水厭氧氨氧化反應器的啟動及最佳運行工藝摸索[J].化學與生物工程，2017，34(4)：63-67.