逍遙散調節慢性應激肝郁脾虛模型大鼠下丘腦弓狀核ob-R、α-MSH變化機制

曠湘楠 王少賢 方朝義 王杰鵬 陳家旭 劉玥蕓

(1 河北中醫學院，石家莊，050200； 2 北京中醫藥大學基礎醫學院，北京，100029)

逍遙散調節慢性應激肝郁脾虛模型大鼠下丘腦弓狀核ob-R、α-MSH變化機制

曠湘楠1王少賢1方朝義1王杰鵬1陳家旭2劉玥蕓2

(1 河北中醫學院，石家莊，050200； 2 北京中醫藥大學基礎醫學院，北京，100029)

目的：研究中藥復方逍遙散(《太平惠民和劑局方》)疏肝解郁、健脾以調節食欲的作用機制。方法：以每天持續3 h慢性束縛應激方法制備動物模型。SD健康雄性大鼠隨機分為正常組、7 d模型組、21 d模型組和逍遙散組4組，正常組予常規飼養，模型組和逍遙散組每天選擇隨機時間點進行束縛應激，7 d模型組束縛應激7 d，21 d模型組束縛應激21 d，逍遙散組在連續束縛應激21 d同時予逍遙散灌胃。觀測各組大鼠體重、攝食量、行為學、血清D-木糖含量變化；免疫熒光雙染、RT-qPCR方法觀測下丘腦ARC中瘦素受體(Leptin Receptor，ob-R)、α-促黑素細胞激素(α-melanocyte Stimulating Hormone，α-MSH)基因與蛋白表達水平。結果：與正常組比較，束縛應激21 d模型大鼠體重、攝食量和血清D-木糖含量明顯降低，行為學實驗表明模型大鼠自主活動能力下降、對新異環境探究行為明顯減少，而逍遙散則具有相應的調節作用。綜合表明，每天3 h連續21 d捆綁束縛可制備慢性應激肝郁脾虛樣動物模型，慢性束縛應激大鼠下丘腦弓狀核(Arcuate Nucleus，ARC)中ob-R、α-MSH表達水平增加，逍遙散可下調其表達。結論：逍遙散調節下丘腦ARC中ob-R和α-MSH表達變化，可作為其疏肝健脾，調節機體食欲和能量代謝影響脾胃功能的作用靶點之一。

慢性應激；逍遙散；肝郁脾虛；瘦素受體；α-促黑素細胞激素

慢性、持久的應激可誘發軀體或心理疾病。由工作問題、家庭問題、經濟問題、人際關系問題等各種生活事件引發的心理應激(心理壓力)，常常引發情緒障礙和以腹脹、食欲減退、大便失調為主要表現的脾胃功能失調，嚴重影響著我們的生活質量。中醫中藥在調治慢性應激方面療效顯著，逍遙散是中醫經典心身同治復方，為國內學者抗應激的首選方劑。

本課題組一直從事中藥復方逍遙散(《太平惠民和劑局方》)防治慢性心理應激研究工作[1-5]，尤其對其調理脾胃運化，調節食欲的效應進行了重點研究。本研究以束縛捆綁方式制備慢性應激動物模型，結合動物攝食量、體重、行為學變化，運用免疫熒光雙染、實時熒光定量(Real-time Fluorescent Quantitative PCR，RT-qPCR)技術與方法，從基因與蛋白水平，檢測下丘腦(Arcuate Nucleus，ARC)中瘦素受體(Leptin Receptor，ob-R)、α-促黑素細胞激素(α-melanocyte Stimulating Hormone，α-MSH)表達，探討逍遙散疏肝解郁、助脾胃運化功能與調食欲的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與分組 SD健康雄性大鼠，體質量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司[動物許可證號：SCXK(京)2012-0001]。清潔級動物房飼養：室溫(21±1)℃，相對濕度40%～60%，光照明暗各12 h(明7：00—19：00，暗19：00—7：00)，自由飲用純凈水，予常規飼養。大鼠適應喂養1周，按體重編號，查隨機數字表，隨機分為4組：正常組、7 d模型組、21 d模型組、逍遙散組各24只，每4只大鼠飼養于1籠，每組6籠。

1.1.2 藥物 逍遙散制備：逍遙散，出自《太平惠民和劑局方》，按照原書組方，由當歸、白芍、柴胡、白術、茯苓、甘草、煨生姜、薄荷8種中藥按3∶3∶3∶3∶3∶1.5∶1∶1比例，由河北中醫學院中藥藥理室進行鑒定和提取，最終制成干粉備用。所有生藥均購自北京同仁堂健康藥業股份有限公司(石家莊店)。提取方法同文獻[4]，最終提取率為18.8%。以去離子水混懸給藥。

1.2 方法

1.2.1 慢性束縛應激模型制備 大鼠束縛于特制的T型束縛架上，束縛架由導師課題組設計：上端束縛臺有兩條可調節松緊的粘帶，用于固定動物胸、腹部；下面是支架，高15 cm。束縛應激方法同文獻[4]。束縛時間點隨機，每天連續3 h束縛制備應激大鼠模型。實驗前和開始實驗后每周稱量1次大鼠體質量、攝食量。于束縛前30 min進行灌胃，正常組每天灌服0.9%生理鹽水；7 d模型組大鼠每天束縛應激3 h連續7 d，同時灌服0.9%生理鹽水；21天模型組大鼠每天束縛應激3 h連續21 d，同時灌服0.9%生理鹽水；逍遙散組大鼠每天束縛應激3 h連續21 d，同時灌服逍遙散[3.854 g/(kg·d)]。

1.2.2 行為學實驗 于實驗前1 d和實驗開始后第7、21天觀測各組大鼠行為學。

1.2.2.1 曠場實驗 長×寬×高為100 cm×100 cm×40 cm曠場箱，底面平分為20 cm×20 cm小正方格的25格。動物運動軌跡由上海欣軟信息科技有限公司提供的行為學記錄分析軟件(Version 2.0)分析：大鼠5 min內活動總路程。

1.2.2.2 高架十字實驗 高架十字迷宮由兩條相對的開放臂、兩條相對的封閉臂、一個聯結四條臂的中央平臺組成。行為學記錄分析軟件分析5 min內大鼠進入開放臂、封閉臂的次數和停留時間。

1.2.3 ELISA方法檢測大鼠血清D-木糖 每組12只大鼠取血2 mL(2管)，離心，分離血清，-20 ℃下保存待測。按照試劑盒說明書步驟操作測定血清D-木糖含量(間苯三酚法)，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2.4 免疫熒光雙染觀測 各組大鼠下丘腦ARC中α-MSH、ob-R蛋白表達水平

1.2.4.1 取材與染色步驟 7 d組于7 d取材，21 d組于實驗第22天取材。各組隨機取6只大鼠予10%水合氯醛腹腔麻醉(0.35～0.40 mL/100 g體質量)，行左心室升主動脈心臟灌注固定，20%、30%蔗糖溶液梯度脫水。Leica CM1950恒溫冷凍切片機切片，片厚25 μm。

免疫染色具體步驟：1)切片用0.01M PBS漂洗后，加入含0.5%TritonX-100的0.01M PBS液，37 ℃，溫箱孵育1 h；2)0.01M PBS漂洗，加入封閉液，室溫孵育，搖床輕搖1 h；3)吸出封閉液，加入1∶100的Rabbit anti-α-MSH polyclonal antibody，4 ℃冰箱孵育，過2夜；4)從冰箱取出室溫平衡30 min，配制漂洗液漂洗；5)加入1∶200的Alexa Fluor@ 594 donkey anti-rabbit IgG，避光，室溫孵育4 h；6)0.01M PBS漂洗，加入封閉液，室溫孵育，輕搖1 h；7)吸出封閉液，加入1∶50的Goat anti-ob-R polyclonal antibody，入4 ℃冰箱孵育，過2夜；8)從冰箱取出，室溫平衡30 min，漂洗液漂洗；9)加入1∶200的Alexa Fluor@ 488 donkey anti-goat IgG，室溫孵育4 h；10)0.01M PBS漂洗，防熒光淬滅封片劑封片。染色過程中涉及到用0.01M PBS漂洗過程，均為每次5 min，漂洗3次；封閉液為含10% donkey serum和0.5%TritonX-100的0.01M PBS；漂洗液為含2% donkey serum和0.5%TritonX-100的0.01M PBS，均每次漂洗5 min，漂洗3次；Ⅰ抗Ⅱ抗稀釋液為含2% donkey serum和0.5%TritonX-100的0.01MPBS。

Donkey serum，購自Millipore Corporation，USA；Goat anti-ob-R polyclonal antibody購自Santa Cruz Biotechnology，Inc.，USA；Rabbit anti-α-MSH antibody購自Phoenix Pharmaceuticals，Inc.，USA；Alexa Fluor@ 594 donkey anti-rabbit IgG和Alexa Fluor@ 488 donkey anti-goat IgG均購自Thermo Fisher，USA。

1.2.4.2 圖像處理 使用Leica SP8激光共聚焦顯微鏡掃描成像，經Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統進行圖像分析。每組10張切片，下丘腦ARC部位選取150 μm×150 μm面積，統計α-MSH、ob-R陽性表達面積(area，μm2)、積分光密度(Intergral optical density，IOD)、陽性細胞表達數(SUM)，及ob-R和α-MSH共染程度(Pearson′s correlation coefficient)。數據處理：Area=area測量值/測量總面積，IOD=IOD測量值/測量總面積。

1.2.5 RT-qPCR方法檢測各組大鼠下丘腦ob-R mRNA、α-MSH mRNA表達

1.2.5.1 取材、總RNA提取、反轉錄和PCR擴增 每組6只大鼠，予10%水合氯醛腹腔麻醉，斷頭，剝取全腦，液氮速凍，干冰環境下切取ARC組織。每個樣本取約50 μg勻漿，采用TRIzol(購自Invitrogen Corporation，Carlsbad，USA)常規操作提取總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳測定RNA純度(OD260/OD280比值在1.8～2.0之間)，表明提取的RNA純度較高，污染很少，可后續反轉錄反應。

根據a M-MLV反轉錄試劑盒(購自Promega Corporation，Madison，USA)說明，將1 μg總RNA轉錄生成cDNAs。然后根據SYBR Green I熒光定量PCR試劑盒(Fermentas Inc.，Canada)采用ABI 7300 Real-time PCR System進行擴增。擴增引物：GAPDH，Forward：5′-TGAACGGGAAGCTCACTG-3′，Reverse：5′-GCTTCACCACCTTCTTGATG-3′，NM_017008，120bp；Ob-R，Forward：5′-GCCAAAGTCAACTACGCTCTT-3′，Reverse：5′-CTTCCATACGCAAACCCA-3′，NM_012596.1，133bp；a-MSH，Forward：5′-CAAGTTCCGCCAGAAACAG-3′，Reverse：5′-TTGCCTTAGCCCTTCGGT-3′，NM_012982.3，116bp。PCR熱循環參數：95 ℃ 5 min，然后40個循環反應：94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，于每個循環的第3個步驟，即：72 ℃ 30 s收集熒光信號。

1.2.5.2 結果分析 擴增完畢后，進入SDS V1.3軟件結果分析界面，設置基線為第3～15個循環，GAPDH為內參照基因，設置對照組的第1號樣品為標準1，得到各樣本各目的基因的Ct值。按照公式RQ=2-△△Ct計算各目的基因表達的相對定量值(RQ值)，將RQ值用于統計分析。

1.3 統計學方法 以SPSS 21.0的一般線性模型(general linear model，GLM)的重復測量過程實現對重復測量資料體重、攝食量、行為學數據的單變量方差分析，并用多因素方差分析過程實現每個時間點上組間的兩兩比較(LSD法)，其他數據采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行統計處理，采用LSD法進行組間比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量和攝食量變化 見表1、表2。

表1 各組大鼠體質量變化比較

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與21 d模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

表2 各組大鼠攝食量變化比較

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。

束縛應激前，3組大鼠體質量、攝食量無統計學差異。束縛第7、14、21天，在相同時間點內21 d模型組大鼠體重明顯低于正常大鼠(P<0.01)；束縛第7、21天，在相同時間點內逍遙散組大鼠體重明顯高于21 d模型組(P<0.05)。束縛第7、14、21天，在相同時間點內21 d模型組大鼠攝食量少于正常組，第7、21天最明顯(P<0.01)；實驗第7、14、21天逍遙散組大鼠攝食量均多于21 d模型組，但組間比較差異均無統計學意義。

2.2 各組大鼠行為學變化

2.2.1 曠場實驗結果 見表3。從表3可以看出，束縛應激前，各組大鼠5 min內活動總路程無統計差異，束縛造模第7天、21天，模型大鼠活動總路程較正常大鼠減少，雖然逍遙散組大鼠5 min內活動總路程較模型大鼠有所增加，但組間比較差異均無統計學意義。

表3 各組大鼠曠場實驗移動總路程

2.2.2 高架十字實驗結果 見表4～表7。在實驗第7、21天，模型大鼠5 min內進入高架十字迷宮開放臂次數和停留時間均較正常大鼠減少，尤其束縛應激21 d大鼠進入開放臂次數減少明顯(P<0.01)；模型大鼠5 min內進入封閉臂次數、停留時間均有所增加，但組間比較無統計學意義。

實驗第21天，5 min內逍遙散組大鼠較單純應激大鼠進入開放臂次數、停留時間有所增多，尤其逍遙散組大鼠在開放臂停留時間增加明顯(P<0.01)；逍遙散大鼠進入封閉臂次數、停留時間均較模型大鼠下降，尤其第7天逍遙散大鼠進入封閉臂次數下降明顯(P<0.01)。

表4 各組大鼠5 min進入開放臂次數比較(n=20，次，

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。

表5 各組大鼠5 min開放臂停留時間比較

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與21 d模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

表6 各組大鼠5 min進入封閉臂次數比較(n=20，次，

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與21 d模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.3 血清D-木糖含量 21 d模型組(0.16±0.01 mmol/L)和逍遙散組(0.66±0.01 mmol/L)大鼠血清D-木糖水平較正常組(0.73±0.12 mmol/L)明顯下降，P<0.05；但逍遙散組大鼠血清D-木糖水平較21 d模型大鼠明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.4 免疫熒光雙染觀測各組下丘腦ARC中ob-R、α-MSH蛋白水平變化 見表8～表10、圖1。

表7 各組大鼠5 min封閉臂停留時間比較

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與21天模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

圖1 各組大鼠下丘腦ARC中а-MSH和ob-R表達

21 d模型組和逍遙散組大鼠下丘腦ARC中ob-R的陽性表達面積、積分光密度和陽性細胞數明顯高于正常組(P<0.01)；逍遙散組大鼠下丘腦ARC中ob-R的陽性表達面積、陽性細胞數較21 d模型組明顯下降(P<0.01)。

7 d模型組、21 d模型組、逍遙散組大鼠下丘腦ARC中α-MSH的陽性表達面積、平均光密度、積分光密度、陽性細胞數均較正常組升高，尤其21 d模型組大鼠α-MSH的陽性表達面積和逍遙散組α-MSH的積分光密度增加明顯(P<0.01)。逍遙散組α-MSH雖然較模型組有所下降，但差異無統計學意義。

21 d模型組大鼠ob-R與α-MSH共表達系數較正常大鼠明顯增加(P<0.01)，逍遙散組的共染程度低于21 d模型組，但組間比較差異無統計學意義。

表8 各組大鼠下丘腦ARC中ob-R表達情況

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與21 d模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

表9 各組大鼠下丘腦ARC中α-MSH表達情況

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。

表10 各組大鼠下丘腦ARC中α-MSH、ob-R共表達情況

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.5 RT-qPCR法觀測各組大鼠下丘腦ARC ob-R mRNA和α-MSH mRNA表達變化

表11 各組大鼠下丘腦ARC ob-R mRNA和α-MSH mRNA表達比較

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與21天模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

從表11可以看出，與正常組比較，7 d模型組大鼠下丘腦ARC中ob-R mRNA與α-MSH mRNA表達均增加，其中ob-R mRNA表達變化更為明顯(P<0.01)；21 d模型組和逍遙散組大鼠下丘腦ob-R mRNA和α-MSH mRNA表達均較正常大鼠明顯增加(P<0.05或P<0.01)；與21 d模型組比較，逍遙散組大鼠下丘腦ARC中ob-R mRNA表達明顯下降(P<0.01)，α-MSH mRNA表達雖然也較21 d模型大鼠下降，但組間比較差異無統計學意義。

3 討論

由于束縛制動可模擬人被長期限制在狹小空間，與人類心身疾病過程相似，屬于純粹的心理挫折應激[6]。本研究采用束縛制動方式制備心理應激動物模型，以逍遙散為干預用藥，以曠場實驗和高架十字實驗客觀觀測大鼠的自主活動能力、對新奇環境的探究行為，分析應激動物出現的心理狀態，結合大鼠攝食、體重和外觀皮毛色澤等的變化，首先觀測了慢性束縛應激21 d大鼠相關變化及灌服逍遙散后的反應。

本研究中，隨著束縛應激時間的延長，21 d模型組大鼠體重增長緩慢，攝食量較正常組大鼠下降；行為學表現在曠場實驗中5 min大鼠活動總路程減少，高架十字實驗中大鼠進入開放臂的次數和停留時間減少，進入封閉臂次數和時間增加，說明大鼠自主活動能力下降，探究性行為減少，對新異環境產生了恐懼、郁悶心理；伴隨應激因素的持續施加，模型大鼠由最初的強烈掙扎反抗，到后期的倦怠懶動、反應遲鈍、毛色枯澀、大便溏結不調的表現；結合模型大鼠血清D-木糖含量明顯下降，說明胃腸消化吸收功能亦下降。綜合表明，心理應激因素的施加首先刺激大鼠出現狂躁、焦慮的情緒反應，但隨著應激因素的持續施加，逐漸出現了郁悶、挫折心理反應和胃腸功能失調的內在變化。采用中藥復方逍遙散干預的應激大鼠，其體重、攝食量、皮毛色澤、行為學均得到一定的改善，與課題組之前報道[3-4,7]一致。方藥反證，也說明每天3 h連續21 d捆綁束縛方式可制備慢性應激肝郁脾虛樣大鼠模型。

ob-R是瘦素(Leptin)的高親和力受體，屬I類細胞因子超家族。功能性ob-R廣泛表達于下丘腦弓狀核、腹內側核、背內側核、室旁核、室周核及下丘腦外側區的神經元[8-9]，這些區域是調節攝食和體重的重要區域。其中ARC在能量代謝調節過程中發揮主要作用[10]。

ARC內的Neuropeptide Y(NPY)/Agout-related peptide(AgRP)神經元和Proopiomelanocortin(POMC)/Cocain and amphetamine-regulated transcript(CART)神經元，前者能增強食欲、抑制能量消耗；后者所分泌的POMC的降解產物α-MSH可起到抑制食欲和促進能量消耗的作用。功能性ob-R與NPY/AgRP和POMC/CART神經元共存[11]，下丘腦ARC中的ob-R被Leptin激活，作用于這兩類神經元，可抑制NPY/AgRP神經元產生和釋放NPY、AgRP，另一方面則可促進POMC神經元產生和釋放α-MSH，從而調節機體的能量代謝、攝食行為和體質量平衡等[12-13]。α-MSH是一種具有強烈的中樞性抑制攝食、促進能量消耗作用的神經肽[14-15]。

本課題組前期研究表明，慢性束縛應激可導致進入下丘腦的Leptin水平增高，刺激功能性ob-R表達增加，Leptin和ob-R特異性地結合，破壞了下丘腦“食欲調節網絡”的平衡[4]。在前期基礎上，本研究重點觀測了ARC中ob-R和α-MSH蛋白與基因表達情況，進一步研究慢性應激影響脾胃功能的中樞神經內分泌機制及逍遙散疏肝健脾調節食欲的作用靶點。

本研究通過RT-qPCR法、免疫熒光雙染方法檢測了模型大鼠下丘腦ARC中ob-R和α-MSH表達變化，結果表明隨著束縛應激因素的持續施加，21 d模型組大鼠下丘腦ARC中ob-R和α-MSH蛋白和基因表達，及ob-R和α-MSH共表達均高于正常組，逍遙散則具有相應的下調其表達作用。說明，外周進入下丘腦的Leptin與ob-R結合后引起大鼠體重和攝食量下降機制與通過調節下丘腦弓狀核α-MSH通路有關，這也可能為慢性應激狀態下逍遙散疏肝健脾，調節機體食欲和能量代謝影響脾胃功能的作用靶點之一。

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(2017-02-20收稿 責任編輯：洪志強)

Mechanism of Xiaoyaosan Decoction on ob-R and α-MSH in arcuate nucleus of hypothalamus of chronic restraint stress modeling rats with liver depression and spleen deficiency

Kuang Xiangnan1, Wang Shaoxian1, Fang Chaoyi1, Wang Jiepeng1, Chen Jiaxu2, Liu Yueyun2

(1HebeiCollegeoftraditionalChinesemedicine,Shijiazhuang050200,China; 2BeijingUniversityofChineseMedicine,SchoolofBasicMedicalSciences,Beijing100029,China)

Objective:To study the mechanism of Xiaoyaosan Decoction in regulating appetite by soothing liver to relieve depression, and invigorating spleen. Methods:SD male rats were randomly divided into four groups; the control group (A), the 7-day model group (B), the 21-day model group (C) and the Xiaoyaosan (XYS) group (D). Except for the control group, models of the other three groups were established by chronic restraint stress method 3 h a day persistently for 7 days, 21 days and 21 days respectively, while Xiaoyaosan Decoction was given in the XYS group at the same time. Body weight, food intake, animal behavior, and the level of D-xylose in the serum were detected in all four groups; the mRNA and protein levels of leptin receptor(ob-R) and-melanocyte stimulating hormone(-MSH) were measured by RT-qPCR and immunofluorescence double staining method. Results:Compared with the control group, the body weight, food intake and the level of D-xylose in the serum were significantly decreased in group C, with decreased autonomous activity and new environment exploratory behavior; while the result of group D showed that Xiaoyaosan Decoction could regulate all of those mentioned above. All together indicated that chronic restraint animal model with liver depression and spleen deficiency can be established by restraining 3 h a day, for 21 days continually; the expression of ob-R and-MSH increased in arcuate nucleus (ARC) of chronic restraint stress rats and Xiaoyaosan Decoction could reduce the expression. Conclusion:The expression of ob-R and-MSH can be regulated by Xiaoyaosan Decoction, indicating that ob-R and-MSH may be the targets of Xiaoyaosan Decoction in regulating the function of spleen and stomach through soothing the liver and invigorating the spleen so as to regulate appetite and energy metabolism.

Chronic Stress; Xiaoyaosan Decoction; Liver depression and spleen deficiency; Leptin Receptor (ob-R);-melanocyte Stimulating Hormone (-MSH)

國家自然科學基金項目(編號：81202644；81673881；81630104)；河北省自然科學基金項目(編號：H2016423049)；高等學校博士學科點專項科研基金資助課題(編號：20121323120016)；河北省教育廳高等學校科學研究項目(編號：QN2014118)

王少賢，女，副教授，醫學博士，碩士研究生導師，E-mail:muhudie@163.com

R228

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.03.003