丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對兔心肌缺血預處理后血管內皮損傷的保護作用

劉家軍 吳 松 李龍珠 敖金波

(1 湖北省十堰市中醫醫院消化科,十堰,442012; 2 十堰市太和醫院康復中心,十堰,442000)

丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對兔心肌缺血預處理后血管內皮損傷的保護作用

劉家軍1吳 松2李龍珠1敖金波2

(1 湖北省十堰市中醫醫院消化科,十堰,442012; 2 十堰市太和醫院康復中心,十堰,442000)

目的:通過建立兔急性心肌缺血/再灌注損傷動物模型,觀察丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對實驗動物心肌缺血預處理后血管內皮損傷的保護作用及其對兔心肌酶譜的影響,探討丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對心功能潛在的影響機制。方法:取24只健康兔隨機分為缺血/再灌注組、缺血預處理A組、缺血預處理B組,其中其中缺血預處理A組按2.5 mL/(kg·d)、缺血預處理B組按5 mL/(kg·d)耳緣靜脈注射丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液進行缺血前預處理,缺血/再灌注組注射1 mL生理鹽水,預處理1周后3組動物均采用手術結扎冠狀動脈前降支30 min后復灌30 min,并反復缺血/再灌注3次的方法造成動物急性心肌缺血/再灌注損傷動物模,另取8只不做任何處理作為對照組。采用雙抗體夾心法測定兔缺血預處理前、后血清血管內皮因子(Vsculr Endothelil Growthfctor,VEGF)及VEGFmRNA表達;酶聯免疫吸附法檢驗(ELIS)兔血清血清總超氧化物歧化酶(T-SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)及心肌丙二醛(MDA)。籍此評價丹參酮Ⅱ磺酸鈉注射液對實驗動物心肌缺血預處理后血管內皮損傷的保護作用及其對兔心肌酶譜的影響。結果:4組動物在缺血預處理前各指標比較差異無統計學意義(P>0.05),在使用丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液缺血預處理后能明顯增強缺血預處理A、B 2組兔VEGF及mRNA表達,明顯提高缺血預處理A組、B 2組T-SOD、LDH及CK-MB酶的活性,降低2組動物心肌酶譜的MD釋放,與缺血/再灌注組比較,差異均有統計學意義(均P<0.05)。缺血預處理A組、B 2組組間比較,差異無統計學意義(均P>0.05)。結論:心肌缺血/再灌注損傷兔在經丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液缺血預處理后,明顯提高VEGF分泌及氧自由基清除酶的活性,加快缺血心肌血管內皮新生,抑制心肌缺血/再灌注損傷時脂質過氧化反應而減輕心肌血管內皮炎性反應,進而改善缺血/再灌注損傷后受損血管內皮功能,對兔急性心肌缺血/再灌注損傷有明確的保護作用。

丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液;心肌缺血/再灌注損傷預處理;血管內皮生長因子;心肌酶譜

丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(Danshen ketone A Sulfonic Acid Sodium Injection)是從中草藥丹參塊莖中純化分離出的二萜醌類化合物經磺化反應而制成的滅菌注射液,主要藥理成份有丹參酮甲酯、丹參酚酸及丹參酮ⅡA等。中醫典籍《吳普本草》中記載其味辛性涼、具涼血消癰、活血通經之功效[1],《本草便讀》謂丹參功同四物,能祛瘀以生新為調理血分之首藥[2]。現代醫學證實其中的丹參素及丹參酮ⅡA具有降低血液黏稠度、清除氧自由基,擴張心肌血管、增加缺血心肌組織血液流量,抑制缺血區組織細胞內鈣超載而發揮組織保護作用[3],對急性心肌缺血時可明顯擴張冠狀動脈,增強心肌收縮力,提高機體耐缺氧能力的作用[4]。現代醫學證實,心肌缺血預處理可明顯提高心肌缺血患者對心肌缺血/再灌注損傷的耐受性,減少嚴重不良事件發生。而丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對心肌缺血/再灌注損傷具有一定的保護作用,但以往對丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液的研究多局限在離體實驗或臨床應用方面,而對整體動物心肌缺血/再灌注損傷時血管再生及心肌酶譜的影響、特別是心肌缺血預處理的影響及作用機制卻鮮有研究,本實驗重點觀察丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對心肌缺血預處理后血管內皮損傷的保護作用及其對兔心肌酶譜的影響,研究藥物作用機制,為臨床應用提供可靠實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與分組 取40只日本大耳白兔,體質量(1.5～1.8)kg,隨機分為對照組、缺血/再灌注組、缺血預處理A、B組共4組。動物房溫度18～25 ℃,濕度50%～75%,動物分籠飼養,自然光照,自由覓食飲水。

1.1.2 藥物 丹參酮ⅡA磺酸鈉(菏澤步長制藥有限公司,批號Z20027877)。

1.1.3 試劑與儀器 戊巴比妥鈉(Sodium Amytal,北京化學試劑公司,批號071222);T-SOD、LDH、CK-MB、MDA測試盒(上海信裕生物技技有限公司,批號XY-A003-1);大鼠組織因子(VEGF)ELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司,批號ml068523),VEGFmRNA反轉錄試劑(上海酶聯生物科技有限公司,批號ml074536);BL-420F生物功能實驗系統(成都泰盟電子有限公司,型號:BL-420F);小動物呼吸機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司,型號:RWD407)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備與缺血預處理方法 在建立兔急性心肌缺血/再灌注損傷動物模型動物模型前,缺血預處理A組按2.5 mL/(kg·d)、缺血預處理B組按5 mL/(kg·d)耳緣靜脈注射丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液,1次/d,連續耳緣靜脈注射7 d,另2組耳緣靜脈注射等體積生理鹽水7 d。1周后缺血/再灌注組、缺血預處理A組,缺血預處理B組3組動物[5],麻醉時用3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射(1 mL/kg),固定時腹部向上并接肢導聯電極,兔Ⅱ導聯心電圖采用BL-420F生物信號采集系統及軟件記錄。手術時用碘伏消毒兔胸部,接小動物呼吸機,于胸骨5～7肋開胸,暴露心臟后用眼科剪剪開心包,找到兔冠狀動脈左側前降支后,在心臟上放一自制氣囊,用小園針從前降支下穿過并結扎絲線,然后用10 mL注射器向氣囊加壓,使氣囊壓迫前降支冠狀動脈造成兔急性心肌缺血,30 min后放出氣囊減壓復灌30 min,這種3次缺血/再灌注的方法可造成動物急性心肌缺血/再灌注損傷動物模,一般在第1次缺血/再灌注均會出現明顯的T波高聳、ST段上抬及期前收縮等心律失常性心電圖即模型成功標準。對照組不做任何手術處理,僅作為空白對照。

1.2.2 檢測指標與方法 4組兔分別于缺血預處理前及缺血預處理后經耳緣靜脈取靜脈血(1 mL),在-30 ℃條件下暫存以備VEGF蛋白分析[6]。檢測時采用雙抗體兩步夾心酶聯免疫吸附法(ELIS)測定動物VEGF蛋白表達的光密度(Opticl density,OD)OD值。取靜脈血標本3 000 r/min離心30 min后取上清液(待測樣本),將標準品、待測樣本加入到預先包被的VEGF單克隆抗體透明酶標包被板中,37 ℃溫育30 min,洗滌后再加入酶標工作液,再于37 ℃下溫育30 min后洗滌除去未結合的成分,依次加入底物,用SP-Mx 3500FL型多功能熒光酶標儀于450 nm波長下測定VEGF的OD值,FLK-1及HIF-1蛋白表達的OD值檢測時分別用FLK-1及HIF-1試劑盒檢測,方法及步驟同VEGF。VEGF-mRNA測定方法[7]:4組兔VEGF-mRNA均采用反轉錄-聚合酶鏈反應(Reverse Trnscription Polymerse Chin Rection,RT-PCR)進行RNA提取后測定。兔靜脈血清T-SOD、CK-MB、LDH、MDA等采用酶聯免疫吸附試驗(ELIS)檢測。

2 結果

2.1 丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對兔血清缺血預處理后T-SOD、LDH活性的影響 4組動物在缺血預處理前血清T-SOD及LDH活性比較(P>0.05),差異無統計學意義。對照組T-SOD、LDH活性在缺血預處理前后無明顯變化(P>0.05);缺血/再灌注組血清T-SOD、LDH水平在缺血預處理后明顯降低,與對照組比較,差異有統計學意義(P<0.05),提示缺血/再灌注組心肌損傷嚴重,造模成功。在缺血預處理后,缺血預處理A、B組T-SOD、LDH含量均明顯增高,與缺血/再灌注組比較,差異有統計學意義(P<0.05),但缺血預處理A、B 2組組間比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對兔缺血預處理后心肌酶譜的影響 4組動物在缺血預處理前心肌酶譜MD及CK-MB含量比較,差異無統計學意義(P>0.05)。對照組缺血預處理前后無明顯變化(P>0.05);缺血/再灌注組MD釋放明顯升高,CK-MB活性降低,與對照組比較,差異有統計學意義(P<0.05),提示缺血/再灌注組急性心肌缺血/再灌注損傷造模成功且心肌損傷嚴重。缺血預處理A、B 2組缺血預處理后CK-MB活性升高、MD血清釋放明顯減少,與缺血/再灌注組比較(P<0.05),但缺血預處理A、B 2組組間比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3 丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對兔缺血預處理后VEGF、VEGFmRNA表達的影響 4組動物在缺血預處理前VEGF及VEGFmRNA表達比較,差異無統計學意義(P>0.05)。對照組VEGF、VEGFmRNA表達在缺血預處理前后無明顯變化,缺血/再灌注組VEGF、VEGFmRNA表達在缺血預處理后均出現一定程度升高,與對照組比較,差異有統計學意義(P<0.05),此時兔心肌酶譜嚴重損傷,提示心肌缺血/再灌注可促進VEGF及VEGFmRNA表達。在經過丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液進行缺血預處理后,缺血預處理A、B 2組VEGF及VEGFmRNA表達均較缺血/再灌注組進一步升高,且與缺血/再灌注組比較,差異有統計學意義(P<0.05)。缺血預處理A、B 2組組間比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表1 丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對日本血清大耳白兔缺血預處理后T-SOD、LDH活性的影響±s,n=10)

注:與對照組比較,*P<0.05;與缺血/再灌注組比較,△P<0.05。

表2 丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對兔缺血預處理后心肌酶譜的影響±s,n=10)

注:與對照組比較,*P<0.05;與缺血/再灌注組比較,△P<0.05。

表3 丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對兔缺血預處理后VEGF、VEGFmRNA表達的影響

注:與對照組比較,*P<0.05;與缺血/再灌注組比較,△P<0.05。

3 討論

急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction,MI),中醫屬心痛、胸痹范疇,其發病主要機制是氣虛血瘀,而西藥認為在冠狀動脈病變如粥樣硬化、梗阻的病理基礎上導致冠狀動脈血供急劇減少或中斷,使缺血區心肌嚴重而持久地急性缺血[8]。流行病學調查顯示急性心肌梗死近年來發病率明顯升高,是造成死亡的主要病因[9],而造成心肌缺血/再灌注損傷主要病因是心肌缺血再灌注,其中又以心肌梗死再通手術,冠狀動脈溶栓治療及手術、冠狀動脈搭橋手術等最為嚴重[10],故缺血前預處理在減輕手術后心肌缺血/再灌注損傷的風險方面可能起到極積預防作用。研究表明,VEGF具有促使血管內皮細胞的增殖、誘導缺血冠狀動脈血管新生并增加血管通透性的作用[11]。而中藥制劑丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液可擴張冠狀動脈血管、增強組織耐缺氧,對缺血/再灌注損傷有明確的保護作用[12]。為探討丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對急性心肌缺血/再灌注損傷預處理后VEGF表達及心肌酶譜等的影響,我們從兔耳緣靜脈注射丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液7 d的方法進行缺血預處理來研究其作用機制。

現代醫學證實,在正常生理代謝狀態下,機體中氧自由基生成與清除及血管內皮功能均維持著動態平衡,當機體發生病理改變如心肌組織由于缺血/再灌注時,組織缺血缺氧會造成清除自由基的酶(總超氧化物歧化酶)活性下降,脂質過氧化反應加劇造成血管內皮細胞嚴重損傷,此時心肌酶譜明顯異常,如血清T-SOD、LDH及CK-MB水平在缺血預處理后明顯降低,MDA大量釋放于血液而導致異常增高,是診斷心肌敏感度和特異度較高“金標準”[13-14]。在缺血/再灌注中,VEGF作為一種高度特異性的促血管生長因子也因缺血刺激而出現增高以彌補心肌缺血缺氧。由于VEGF具有促進血管內皮細胞增殖遷移再生、誘導多種血管活性物質合成,在MI時可能參與缺血心臟冠狀動脈血管內皮新生,促進側支循環的形成方面起到極積作用,故MI時VEGF可作為反映血管內皮生長及代謝功能的重要檢測指標之一。在本實驗中,4組動物在缺血預處理前各指標比較差異無統計學意義(P>0.05),缺血/再灌注組VEGF蛋白質及mRNA表達增強,LDH、T-SOD、CK-MB酶的活性下降,MDA合成明顯增多,說明急性心肌缺血/再灌注損傷、缺氧是促進VEGF分泌的最主要因素,血管內皮遭受氧自由基破壞而嚴重受損。在使用丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液缺血預處理后能明顯增強缺血預處理A、B 2組兔VEGF及mRNA表達,明顯提高缺血預處理A、B 2組T-SOD、LDH及CK-MB酶的活性,降低缺血預處理A、B 2組動物心肌酶譜的MD釋放。提示參酮ⅡA磺酸鈉注射液能明顯抑制MDA合成與釋放,降低急性心肌缺血/再灌注損傷后氧自由基的產生及脂質過氧化反應。同時還通過增加缺血心肌VEGF分秘來誘導缺血冠狀動脈血管新生,從而達到促進重建側枝循環、降低缺血/再灌注損傷的目的。這種作用可能與丹參酮ⅡA恢復Ca2+-ATP酶活性,抑制過度Na-Ca2+交換造成的心肌細胞鈣超載導致的急性心肌梗死有關[15-16]。同時,丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液的主要有效果成分丹參酮具有活血化瘀的藥理作用,可明顯降低血黏度,改善微循環,擴張冠狀動脈增加血流量,增加缺血心肌供氧及能量代謝而起到缺血/再灌注損傷的保護作用[17-18]。總之,實驗動物兔在造成心肌缺血/再灌注損傷前,在經丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液進行缺血預處理,可明顯提高VEGF分泌及氧自由基清除酶的活性,加快缺血心肌血管內皮新生,促進血管新生,抑制心肌缺血/再灌注損傷時脂質過氧化反應而減輕心肌血管內皮炎性反應,進而改善缺血/再灌注損傷后受損血管內皮功能,對兔急性心肌缺血/再灌注損傷有明確的保護作用。

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(2015-11-19收稿 責任編輯：王明)

Protective effect of Danshen A Sodium Sulfonate Injection on Vascular Endothelial Injury after Ischemic Preconditioning in Rabbits with Myocardial Ischemia Preconditioning

Liu Jiajun1,Wu Song2,Li Longzhu1,Ao JinBo2

(1ShiyanChineseMedicineHospital,Shiyan442012,China; 2ShiyanTaiheHospital,AffiliatedHospitalofHubeiMedicalCollege,Shiyan442000,China)

Objective:To observe the protective effect of Danshen A sodium sulfonate injection on myocardial ischemia and reperfusion injury in rabbit,investigate the effect of Danshen A sodium sulfonate injection on myocardial enzyme spectrum and explore its potential mechanism to heart function.Methods:Twenty-four rabbits were randomly divided into ischemia/reperfusion group,ischemic preconditioning processing group A,and ischemic preconditioning group B.Ischemic preconditioning processing group A was injected via ear vein with Danshen A sodium sulfonate injection at 2.5 mL/kg/d,while ischemic preconditioning treatment group B at 5 mL/kg/d and ischemia/reperfusion group were injected with 1 mL physiological saline.After a week preprocessing,rabbits in all groups were ligated at coronary artery and was re-perfused for 30 minutes,30 minutes after ligation.The rest 8 rabbits were fed up as control group.Vascular endothelial growth factor (VEGF) and VEGF mRN expression before and after processing were measured by double antibody sandwich EUS,and serum total superoxide dismutase (T-SOD),lactate dehydrogenase (LDH),creatine kinase isoenzyme (CK-MB) and myocardial malondialdehyde (MDA) were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELIS).The protective effect of Danshen A sodium sulfonate injection on vascular endothelial injury and its effect on myocardial enzyme spectrum in rabbits after myocardial ischemia preconditioning were evaluated.Results:Differences of the four groups in ischemic preconditioning showed no significance (P>0.05),VEGF and mRN expression in both group A and B after preprocessing were significantly enhanced,and T-SOD,LDH and CK-MB of were obviously improved and the release of MD declined in the two groups with statistically significant difference compared with the ischemia/reperfusion group (P<0.05).There was no significant difference between the ischemic preconditioning group A and group B (P>0.05).Conclusion:Danshen A sodium sulfonate injection on myocardial ischemia and reperfusion injury in rabbits may significantly increase VEGF and enhance LDH activity,accelerate myocardial ischemia vascular endothelial growth,inhibit lipid peroxidation inhibition and reduce myocardial vascular endothelial inflammatory response,thereby improving impaired endothelial function due to ischemia/reperfusion injury.It has clear protective effects on rabbit experimental myocardial ischemia/reperfusion injury.

Danshen A sodium sulfonate injection; Myocardial ischemia/reperfusion injury preconditioning; Vascular endothelial growth factor; Myocardial enzyme spectrum

湖北省教育廳教育科學“十二五”規劃課題(編號:2014B095)

劉家軍(1974.09—),男,大學本科,主治醫師,消化科主任,研究方向:從事中藥藥理學與心血管研究,E-mail:18772877526@163.com

敖金波(1977.02—),男,碩士,主治醫師,副主任,研究方向:從事中藥藥理學研究,E-mail:lilongzhu727@sina.cn

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.03.036