柱前衍生化HPLC法測定鐵皮石斛破壁飲片中甘露糖的含量

晏薇娜　喬楊　張敏　田民義　王慧娟

摘要：采用柱前衍生化HPLC法測定了12批鐵皮石斛破壁飲片中甘露糖的含量。藥材采用80%乙醇回流提取除雜后，水煎煮制得石斛多糖，然后將多糖經酸水解為單糖，再用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（ PMP）進行衍生化處理，以鹽酸氨基葡萄糖作為內標進樣測定。結果平均校正因子為08248，RSD為063%，平均加樣回收率為9803%。每批鐵皮石斛破壁飲片中單糖含量存在明顯差異，但均符合藥典要求。

關鍵詞：柱前衍生化；鐵皮石斛；甘露糖；HPLC；含量測定

中圖分類號：R927 2

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2017）02-0090-05國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.02.020

Abstract：Pre-column derivatization HPLC method was adopted to measure mannose content in 12 batches of Dendrobium. After removing impurity by reflux extraction with 80% ethanol， Dendrobium polysaccharides of the medicinal materials were prepared by water decoction， and then hydrolyzed into monosaccharides which was treated with 1- phenyl -3- methyl -5- （PMP）. Glucosamine hydrochloride was used as the internal standard for sample determination. The results showed that the average correction factor was 08248， RSD was 063%， and the average recovery was 9803%. Although significant differences in the content of monosaccharide in each batch of medicinal materials were observed， they all met the pharmacopoeia requirements..

Key words：pre-column derivatization； dendrobium； mannose； HPLC； determination of content

鐵皮石斛藥材是蘭科植物鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo的干燥莖，具有益味生津，滋陰清熱的功效[1]，現代藥理學研究表明，鐵皮石斛多糖具有增強免疫力、降血糖、降血壓、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用[2-5]，為其主要藥效成分。經研究，鐵皮石斛多糖主要由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖組成，其中甘露糖的含量最高[6-7]。破壁飲片是采用現代超微技術，將中藥飲片粉碎至300目、粒徑小于45微米，可供直接口服使用的新型中藥飲片。中藥破壁飲片具有高效免煎、攜帶方便、質量可控、安全衛生等特點，因此成為近年中藥研究的熱點[8]。

本實驗采用柱前衍生化HPLC法，測定了貴州某企業提供的12批鐵皮石斛破壁飲片中甘露糖的含量。為鐵皮石斛破壁飲片的質量控制提供了依據，對石斛多糖的活性研究具有進一步的意義。

1材料與方法

11儀器與試藥

111儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，G1311B輸液泵，G1316A柱溫箱，G1329B自動進樣器，G4212B-DAD檢測器，Chemstation色譜工作站。超聲儀（KQ-500型，昆山市超聲儀器有限公司），循環水式多用真空泵（SHB- IIIS，鄭州長城科工貿有限公司），分析天平（METTLER TOLEDO）。

112試劑

乙腈為色譜純，水為純凈水，甲醇、乙醇、三氯甲烷、PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）、氫氧化鈉、鹽酸、乙酸銨均為分析純；葡萄糖對照品（中國食品藥品檢定研究院提供，供含量測定用，批號：110833-201506，含量999%）；甘露糖對照品（中國食品藥品檢定研究院提供，供含量測定用，批號：140651-201403，含量996%）；鹽酸氨基葡萄糖對照品（中國食品藥品檢定研究院提供，供含量測定用，批號：140649-201505，含量99%）。

12實驗方法

121色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（46mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈-002mol/L的乙酸銨溶液（19∶81）；檢測波長：250nm；流速：07mL/min；柱溫：30℃；進樣量：10μL。

122對照品溶液和內標溶液的制備內標溶液：取鹽酸氨基葡萄糖適量，精密稱定，加水制成每1mL含1204mg的溶液，即得。

內標稀釋液（10倍）：精密量取內標溶液10mL，置10mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

內標稀釋液（100倍）：精密量取內標溶液10mL，置100mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

甘露糖對照品貯備液：精密稱定甘露糖對照品5040mg，置50mL量瓶中，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

甘露糖對照品溶液：精密量取甘露糖對照品貯備液10mL，置10mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

加內標的甘露糖對照品溶液：精密稱定甘露糖對照品1015mg，置100mL量瓶中，精密加入內標溶液1mL，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

123多糖的水解

取鐵皮石斛破壁飲片約012g，置索氏提取器中，加80%乙醇適量，加熱回流提取4小時，棄去乙醇液，藥渣揮干乙醇，濾紙筒拆開置于燒杯中，加水100mL，再精密加入內標溶液2mL，煎煮1小時并時時攪拌，放冷，加水補至約100mL，混勻，離心，吸取上清液1mL，置頂空瓶中，加30mol/L的鹽酸溶液05mL，封口，混勻，110℃水解l小時，放冷，用30mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值至中性，備用。

124衍生化產物的制備

取對照品溶液、內標溶液和供試品溶液400μL，加05mol/L的PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）甲醇溶液與03mol/L的氫氧化鈉溶液各400μL，混勻，70℃水浴反應100分鐘。再加03mol/L的鹽酸溶液500μL，混勻，用三氯甲烷洗滌3次，每次2mL，棄去三氯甲烷液，水層離心后，取上清液10μL，注入液相色譜儀，測定。

2 結果與分析

21系統適用性試驗

分別吸取空白溶液、內標稀釋液（100倍）、甘露糖對照品溶液、加內標的甘露糖對照品溶液、加內標的供試品溶液的衍生產物進樣測定，供試品溶液和對照品溶液中甘露糖、氨基葡萄糖的保留時間一致，理論板數按甘露糖峰計算大于4000。供試品溶液中甘露糖、氨基葡萄糖與其相近的峰分離度大于15，結果如圖1。

22線性關系的考察

精密量取甘露糖對照品貯備液02mL、04mL、06mL、08mL、10mL、12mL、20mL、40mL，分別置l0mL量瓶中，精密加入內標稀釋液（10倍）10mL，加水稀釋至刻度，搖勻，吸取400μL，衍生化處理后進樣10μL測定，記錄色譜圖。以濃度比C對照品/C內標為橫坐標（X），相應的峰面積比A對照品/A內標為縱坐標（Y）（見圖2），計算回歸方程為：y = 1257x - 00303（R2 = 09996）。

23精密度試驗

精密量取甘露糖對照品貯備液08mL、10mL、12mL，分別置10mL量瓶中，精密加入內標稀釋液（10倍）10mL，加水稀釋至刻度，搖勻，吸取400μL，衍生化處理后進樣測定，記錄色譜圖，按式（1）計算校正因子f，結果見表1。平均校正因子為08248，RSD為063%。

校正因子（f）=A內標/C內標A對照品/C對照品（1）

24重復性試驗

取第一批鐵皮石斛破壁飲片，按“123”項下方法處理，平行制備6份供試品，再衍生化后分別進樣10μL，結果甘露糖的平均含量為1568mg/g，RSD為263%（見表2），表明方法重復性良好。

25穩定性試驗

取供試品溶液，分別于衍生化后0、4、8、12、24h進樣測定，結果甘露糖衍生物峰面積在24h內基本無變化，RSD為112%（見表3），說明供試液衍生化后在24h內穩定性良好。

26加樣回收率試驗

精密稱取第一批鐵皮石斛破壁飲片6份，每份約006g，置索氏提取器中，加80%乙醇適量，加熱回流提取4h，棄去乙醇液，藥渣揮干乙醇，濾紙筒拆開置于燒杯中，加水100mL，再精密加入內標溶液2mL和甘露糖對照品約90mg，煎煮1h并時時攪拌，放冷，加水補至約100mL，混勻，離心，吸取上清液1mL，置頂空瓶中，加30mol/L的鹽酸溶液05mL，封口，混勻，110℃水解1h，放冷，用30mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值至中性，吸取400μL，衍生化處理后進樣測定，計算回收率，結果如表4。

27樣品測定

取12批鐵皮石斛破壁飲片約012g，按“123”和“124”項下方法處理，每批飲片平行制備3份供試品溶液，然后進樣10μL進行測定，計算甘露糖含量、甘露糖和葡萄糖峰面積比，結果見表5。

3討論

多糖是鐵皮石斛的主要有效成分，其主要由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖組成[9]，其中含量最多的是甘露糖，因此在多糖研究基礎上，利用甘露糖作為含測指標，更能全面客觀的評價出鐵皮石斛的質量。本實驗結果甘露糖含量范圍為1602%～2781%，可能是由于12批成破壁飲片在粉碎后粒度差異的原因，顯示出每批飲看的質量良莠不齊，且不具規律性，但均符合藥典標準。

由于單糖在紫外區沒有吸收，因此不能用常規的紫外檢測器來檢測。根據文獻，常用的檢測單糖的主要方法有HPLC-RID法、柱前衍生化高效液相色譜法、HPLC-ELSD法等[10]。HPLC-RID法選擇性較差，對流動相、柱溫等太敏感，而HPLC-ELSD法的研究還較少，不夠成熟。本實驗采用柱前衍生化HPLC法，以鹽酸氨基葡萄糖作為內標，以DAD為檢測器，測定了鐵皮石斛破壁飲片中甘露糖的含量。結果表明該方法能夠快速、靈敏、準確地測定出單糖。

參考文獻：

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