港口航道致病性細(xì)菌檢測(cè)微陣列基因芯片的研制

摘要：【目的】制備出一套針對(duì)港口航道致病性細(xì)菌檢測(cè)的基因芯片，為港口航道基因芯片檢測(cè)技術(shù)的研究及應(yīng)用打下基礎(chǔ)?！痉椒ā坎捎贸Ｒ?guī)方法提取目標(biāo)菌株基因組DNA，以16S rDNA通用引物和gyrB基因保守區(qū)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用AlleleID 6.0和Array Designer 4.25對(duì)擴(kuò)增獲得的目的片段進(jìn)行寡核苷酸探針設(shè)計(jì)，經(jīng)PCR篩選驗(yàn)證，目標(biāo)探針以氨基化修飾后通過(guò)芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)制在醛基玻片上；優(yōu)化芯片雜交固定條件，并用于港口航道的水樣檢測(cè)，以驗(yàn)證微陣列基因芯片的檢測(cè)效果。【結(jié)果】?jī)?yōu)化后的芯片雜交固定條件為探針點(diǎn)樣濃度10 μmol/L、紫外交聯(lián)時(shí)間2.0 h、雜交溫度65 ℃，有效提高了基因芯片檢測(cè)的靈敏度，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比可實(shí)現(xiàn)快速、高通量、準(zhǔn)確的目標(biāo)。研制的微陣列基因芯片可特異性檢測(cè)出港口航道中含有的霍亂弧菌（Vibrio cholerae）、陰溝腸桿菌（Emterobacter cloacae）、溶藻弧菌（V. alginolytivus）、哈氏弧菌（V. harveyi）、副溶血弧菌（V. parahemolyticus）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）和創(chuàng)傷弧菌（V. vulnificus）等7株致病性細(xì)菌，且均未出現(xiàn)非特異性雜交?！窘Y(jié)論】針對(duì)港口航道致病性細(xì)菌建立的微陣列基因芯片檢測(cè)技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速便捷的特點(diǎn)，可用于港口航道及周邊地區(qū)的海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)和海產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)。

關(guān)鍵詞： 致病性細(xì)菌；港口航道；基因芯片；檢測(cè)

中圖分類號(hào)： S917.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）07-1304-06

0 引言

【研究意義】作為人類航海活動(dòng)和貨物進(jìn)出口的集散地，港口航道及其附近水域的生態(tài)狀況對(duì)海洋生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生重要影響。港口航道病原菌監(jiān)測(cè)是海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)的重要內(nèi)容之一（陳斯婷，2008）。目前，病原菌檢測(cè)在醫(yī)學(xué)上已十分成熟，但在水產(chǎn)養(yǎng)殖、水環(huán)境監(jiān)控等方面尚未實(shí)現(xiàn)快速、低成本、高通量等檢測(cè)目標(biāo)，大多數(shù)國(guó)家仍沿用傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)鑒定方法，檢測(cè)周期長(zhǎng)、操作繁瑣、靈敏度低，且每次只能檢測(cè)出一種致病菌，面對(duì)日益增加的多重混合污染，該檢測(cè)方法顯得嚴(yán)重滯后?；蛐酒墙臧l(fā)展起來(lái)的一種高新生物技術(shù)，可對(duì)多種靶基因同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)鑒定，憑借其快速、高通量、平行化等特點(diǎn)已得到廣泛應(yīng)用（陳昱等，2009）。因此，建立一種基于基因芯片技術(shù)的多病原菌檢測(cè)方法，對(duì)加強(qiáng)港口航道病原菌監(jiān)測(cè)及采取有效預(yù)防措施具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】1995年，Schena等首次發(fā)表了關(guān)于基因芯片研究的科技論文；1996年底，F(xiàn)odor研制出第一塊DNA芯片。隨后，陸續(xù)有學(xué)者將基因芯片應(yīng)用于食品致病菌檢測(cè)。Call等（2001）報(bào)道，采用基因芯片檢測(cè)鑒定大腸桿菌O157∶H7不同基因型時(shí)，其靈敏度（1 fg）是多重PCR的32倍。González等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，采用基因芯片檢測(cè)海水病原菌的靈敏度也比多重PCR高，可在20 fg以下。此外，基因芯片可解決多重PCR對(duì)部分菌株無(wú)法進(jìn)行分型的問(wèn)題。AI-Khaldi等（2004）、Jung等（2004）均研究表明，采用基因芯片檢測(cè)病原菌的靈敏度明顯高于多重PCR，且在菌株分型方面具有更大優(yōu)勢(shì)。在國(guó)內(nèi)，唐曉敏和高志賢（2003）率先將基因芯片檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于水體細(xì)菌檢測(cè)；蔣紅霞等（2004）研制出寡核苷酸芯片用于檢測(cè)獸醫(yī)病原菌耐藥性；曹三杰等（2009）以S、S3、sM、M、N、ORF7、POL等為靶基因，構(gòu)建了豬傳染性胃腸炎病毒檢測(cè)基因芯片；李晨等（2011）研制出針對(duì)3種水產(chǎn)病原菌的簡(jiǎn)型基因芯片，并將基因芯片技術(shù)推廣到水產(chǎn)領(lǐng)域；朱業(yè)培等（2015）以線粒體DNA基因（mtDNA）和細(xì)胞色素b基因（cytb）為目標(biāo)基因，建立了可同時(shí)鑒別牛、羊、豬、馬、鹿、兔6種動(dòng)物源性成分的基因芯片檢測(cè)技術(shù)，為我國(guó)肉及肉制品快速檢測(cè)和種屬鑒別提供了技術(shù)支持；楊國(guó)淋等（2016）將不對(duì)稱PCR和基因芯片兩種技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建了同步檢測(cè)雞傳染性喉氣管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus，ILTV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）的基因芯片?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，基因芯片技術(shù)已普遍應(yīng)用于動(dòng)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗生物和非生物逆境、病蟲(chóng)害檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)、品質(zhì)和產(chǎn)量形成等研究（肖翔等，2012；薛輝等，2015；蘇寧等，2016），在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域取得了巨大成就，但至今尚無(wú)運(yùn)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)上海港口航道致病性細(xì)菌的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】根據(jù)分離獲得的港口航道致病性菌株，設(shè)計(jì)一套特異性引物和探針，優(yōu)化芯片雜交固定條件，制備出檢測(cè)港口航道致病性細(xì)菌的基因芯片，為港口航道基因芯片檢測(cè)技術(shù)的研究及應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)菌株是從上海洋山港港口航道分離鑒定獲得的7株致病性菌株，分別為：副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydro-

phila）、霍亂弧菌（V. cholerae）、陰溝腸桿菌（Entero-

bacter cloacae）、哈氏弧菌（V. harveyi）、溶藻弧菌（V. alginolyticus）和創(chuàng)傷弧菌（V. vulnificus）。光學(xué)級(jí)醛基基片、芯片雜交盒、芯片蓋片、芯片和蓋片儲(chǔ)存盒、微陣列芯片離心管、雜交Buffer、紫外交聯(lián)儀、晶芯Lux Scan 10K微陣列芯片掃描儀等購(gòu)自北京博奧生物有限公司；細(xì)菌基因組抽提試劑盒、Klenow酶及DL2000 DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司；圓底低容量NBS表面384孔板購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

1. 2 含特異性探針的目的片段擴(kuò)增

16S rDNA通用引物（27F-1492R）和gyrB基因保守區(qū)引物（gyrB-F：5'-AAGCGHCCNGSNATGTAYATHG

G-3'，gyrB-R：5'-CCNGCNGARTCNCCYTCNAC-3'）由上海杰李生物技術(shù)有限公司合成。以試劑盒提取目標(biāo)菌株基因組DNA后，采用以上引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以期獲得含特異性探針的目的片段。

1. 3 探針設(shè)計(jì)與合成

使用AlleleID 6.0和Array Designer 4.25對(duì)上述擴(kuò)增獲得的目的片段進(jìn)行寡核苷酸探針設(shè)計(jì)。選擇特異性高、引物二聚體少、退火溫度（Tm）盡可能接近的片段，設(shè)計(jì)長(zhǎng)度約40 bp。針對(duì)每株致病性菌株設(shè)計(jì)1～3條探針，詳見(jiàn)表1。探針5'端氨基化修飾與合成均由上海杰李生物技術(shù)有限公司完成。

1. 4 芯片點(diǎn)制

將合成的探針與芯片點(diǎn)樣液等體積混合后，按點(diǎn)陣布局（圖1）點(diǎn)制在醛基基片上。通過(guò)水合（37 ℃下水合溫育2 h，過(guò)夜干燥）、紫外交聯(lián)（參數(shù)設(shè)為2400 MJ/cm2）加強(qiáng)探針固定效果，經(jīng)NaBH4還原后以0.2% SDS和無(wú)菌水洗凈，4 ℃避光保存。

1. 5 芯片雜交

將PCR擴(kuò)增獲得的特異性片段用帶Cy3熒光素標(biāo)記的隨機(jī)引物9N進(jìn)行熒光標(biāo)記（用Klenow酶進(jìn)行標(biāo)記）。將雜交Buffer與熒光標(biāo)記物配制成雜交體系20.0 μL，即4×雜交Buffer 5.0 μL，熒光標(biāo)記產(chǎn)物15.0 μL；然后以芯片雜交盒進(jìn)行雜交，65 ℃水浴2 h。芯片掃描儀掃描芯片（激光強(qiáng)度100%，PMT為100%），記錄檢測(cè)圖譜。

1. 6 芯片雜交條件優(yōu)化

1. 6. 1 探針點(diǎn)樣濃度確定 采用晶芯Smart Arrayer 48微陣列芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)以不同濃度點(diǎn)片，探針終濃度設(shè)30、20、10和5 μmol/L 4個(gè)梯度。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1. 6. 2 UV紫外交聯(lián)時(shí)間確定 紫外照射能量和交聯(lián)時(shí)間對(duì)探針與芯片的結(jié)合固定有著直接影響。在設(shè)定紫外交聯(lián)能量為2400 MJ/cm2的前提下，設(shè)交聯(lián)時(shí)間分別為0.5、1.0、2.0和4.0 h。

1. 6. 3 雜交溫度確定 雜交溫度是影響雜交效果的重要因素，將點(diǎn)制完成玻片與熒光標(biāo)記后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交，雜交溫度設(shè)為55、60和65 ℃，分別雜交2.0 h。

1. 7 港口航道海水樣品檢測(cè)

分別于春、夏、秋三個(gè)季節(jié)采集上海洋山港附近5個(gè)水域（采樣點(diǎn)1：東經(jīng)122°2′513″，北緯30°38′276″；采樣點(diǎn)2：東經(jīng)122°4′150″，北緯30°37′；采樣點(diǎn)3：東經(jīng)122°5′266″，北緯30°36′263″；采樣點(diǎn)4：東經(jīng)122°5′680″，北緯30°36′30″；采樣點(diǎn)5：東經(jīng)122°6′915″，北緯30°35′250″）的水樣，同一采樣時(shí)間的5個(gè)水樣混勻后作為1份待測(cè)海水樣品，分別編號(hào)為海水樣品1、海水樣品2和海水樣品3。經(jīng)定性濾紙抽濾、0.45和0.22 μm孔徑硝酸纖維素膜過(guò)濾后，收集濾液多次過(guò)濾，10000 r/min離心濃縮至5.0 mL以內(nèi)。菌體濃縮液樣品經(jīng)LB液體培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)（200 r/min，12 h），提取各菌株基因組總DNA，以16S rDNA通用引物和gyrB基因保守區(qū)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，與優(yōu)化后的芯片進(jìn)行雜交。

2 結(jié)果與分析

2. 1 含特異性探針目的片段的擴(kuò)增結(jié)果

由圖2可看出，從7株目標(biāo)菌株中均擴(kuò)增獲得16S rDNA（約1400 bp）和gyrB基因（約1000 bp）目的片段。

2. 2 芯片雜交條件優(yōu)化結(jié)果

選擇不同的探針點(diǎn)樣濃度、紫外交聯(lián)時(shí)間和雜交溫度等進(jìn)行雜交后，記錄各雜交掃描結(jié)果。在探針點(diǎn)樣濃度達(dá)10 μmol/L時(shí)，掃描熒光強(qiáng)度為3578，即可產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的清晰雜交信號(hào)（圖3）；紫外交聯(lián)時(shí)間為2.0 h已有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度（圖4），既可滿足芯片檢測(cè)的快速要求，又能縮短芯片檢測(cè)時(shí)間；當(dāng)雜交溫度達(dá)65 ℃時(shí)，雜交信號(hào)較其他溫度強(qiáng)（圖5）。

2. 3 基因芯片檢測(cè)結(jié)果

基因芯片檢測(cè)結(jié)果（圖6）表明，7株目標(biāo)菌株間均未出現(xiàn)非特異性雜交，說(shuō)明設(shè)計(jì)的探針具有良好特異性，可用于副溶血弧菌、霍亂弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌、陰溝腸桿菌等病原菌的檢測(cè)。

2. 4 港口航道海水樣品檢測(cè)結(jié)果

以優(yōu)化的基因芯片雜交檢測(cè)采集到的3份海水樣品，結(jié)果（圖7）顯示，海水樣品1檢出霍亂弧菌、哈氏弧菌、嗜水氣單胞菌、陰溝腸桿菌和溶藻弧菌，海水樣品2檢出霍亂弧菌、哈氏弧菌、嗜水氣單胞菌、陰溝腸桿菌和溶藻弧菌，海水樣品3檢出霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌。

3 討論

目前在港口航道微生物檢測(cè)中，對(duì)細(xì)菌的檢測(cè)仍以傳統(tǒng)微生物檢測(cè)與PCR相結(jié)合的方法為主，而采用基因芯片進(jìn)行檢測(cè)的研究較少。在重要海域致病性細(xì)菌檢測(cè)方面，基因芯片檢測(cè)技術(shù)已初顯成效。郭建麗（2014）采用PCR與基因芯片相結(jié)合的方法，從大連海域的海濱浴場(chǎng)檢測(cè)出6種致病性細(xì)菌。本研究以港口航道致病性細(xì)菌為目標(biāo)菌株，選擇16S rDNA通用引物以提高檢測(cè)效率；并通過(guò)對(duì)探針點(diǎn)樣濃度、紫外交聯(lián)時(shí)間和雜交溫度等條件的優(yōu)化，最終確定探針點(diǎn)樣濃度為10 μmol/L、紫外交聯(lián)時(shí)間為2.0 h、雜交溫度為65 ℃，有效提高了基因芯片檢測(cè)的靈敏度，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比可實(shí)現(xiàn)快速、高通量、準(zhǔn)確的目標(biāo)。

特異性是基因芯片檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵，與選取的靶基因和篩選的引物、探針密切相關(guān)（肖翔等，2012；薛輝等，2015；蘇寧等，2016）。由于本研究中副溶血弧菌、霍亂弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌和溶藻弧菌等5株目標(biāo)菌株的遺傳關(guān)系相近，因此在選擇靶基因時(shí)需嚴(yán)格篩選，且探針的特異性越高越好。將本研究設(shè)計(jì)的探針和引物在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)每條探針和引物序列均具有很高的特異性，且均未出現(xiàn)非特異性雜交。基因芯片檢測(cè)靈敏度是評(píng)價(jià)一種鑒定新方法的重要指標(biāo)之一。本研究結(jié)果顯示，在探針點(diǎn)樣濃度10 μmol/L、掃描熒光強(qiáng)度3578的條件下，即可產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的清晰雜交信號(hào)，具有極高的靈敏度。基因芯片檢測(cè)技術(shù)不需要通過(guò)擴(kuò)增目的片段來(lái)對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷，更適合于復(fù)雜基質(zhì)樣本致病菌的檢測(cè)與鑒定。本研究利用檢測(cè)這一優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)副溶血弧菌、霍亂弧菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌和陰溝腸桿菌等7株致病性細(xì)菌進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，具有良好的特異性，可在10 h內(nèi)完成檢測(cè)鑒定，較常規(guī)的細(xì)菌學(xué)診斷更快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)和實(shí)用，為流行病學(xué)調(diào)查和突發(fā)性傳染病早期診斷提供了一種有效的檢測(cè)手段。

4 結(jié)論

針對(duì)港口航道致病性細(xì)菌建立的微陣列基因芯片檢測(cè)技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速便捷的特點(diǎn)，可用于港口航道及周邊地區(qū)的海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)和海產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)：

曹三杰，黃小波，文心田，肖國(guó)生. 2009. 豬傳染性胃腸炎病毒檢測(cè)基因芯片的構(gòu)建[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，29（2）：121-124. [Cao S J，Huang X B，Wen X T，Xiao G S. 2009. Construction of detecting genechip for transmissible gastroenteritis virus[J]. Chinese Journal of Veterinary Science，29（2）：121-124.]

陳斯婷. 2008. 海洋環(huán)境影響評(píng)價(jià)的技術(shù)范式研究[D]. 廈門(mén)：廈門(mén)大學(xué). [Chen S T. 2008. Research on the technical para-

digm of marine environmental impact assessment[D]. Xiamen：Xiamen University.]

陳昱，潘迎捷，趙勇，金維榮，秦紅友，徐曉晶，唐明未. 2009. 基因芯片技術(shù)檢測(cè)3種食源性致病微生物方法的建立[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，36（2）：285-291. [Chen Y，Pan Y J，Zhao Y，Jin W R，Qin H Y，Xu X J，Tang M W. 2009. Detection of three foodborne pathogenic microorganisms by DNA microarray[J]. Microbiology，36（2）：285-291.]

郭建麗. 2014. 海水浴場(chǎng)常見(jiàn)致病菌PCR方法和基因芯片檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[D]. 大連：大連海洋大學(xué). [Guo J L. 2014. The establishment and application of PCR and microarray detection method of common pathogens in seawater[D]. Dalian：Dalian Ocean University.]

蔣紅霞，陳杖榴，曾振靈，鄧旭明，歐陽(yáng)紅生，李瑤. 2004. 寡核苷酸芯片檢測(cè)獸醫(yī)病原菌耐藥性的研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，37（9）：1385-1389. [Jiang H X，Chen Z L，Zeng Z L，Deng X M，Ouyang H S，Li Y. 2004. Study on detection of resistance in veterinary pathogen by using oligonucleotide array[J]. Scientia Agricultura Sinica，37（9）：1385-1389.]

李晨，黃倢，謝國(guó)駟，趙培，王秀華. 2011. 3種水產(chǎn)病原菌簡(jiǎn)型基因芯片檢測(cè)技術(shù)的建立[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，41（3）：37-42. [Li C，Huang J，Xie G S，Zhao P，Wang X H. 2011. Establishment of a reduced microarray for detection of three aquatic bacterial pathogens[J]. Periodical of Ocean University of China，41（3）：37-42.]

蘇寧，楊麗，劉娟，周荷益，張思華，雷芳敏，蘭嵐，鄭洪艷. 2016. 基因芯片技術(shù)的國(guó)內(nèi)應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通訊，27（2）：289-292. [Su N，Yang L，Liu J，Zhou H Y，Zhang S H，Lei F M，Lan L，Zheng H Y. 2016. Application research progress of gene chip technology in China[J]. Letters in Biotechnology，27（2）：289-292.]

唐曉敏，高志賢. 2003. 基因芯片快速檢測(cè)常見(jiàn)水中致病菌的初步應(yīng)用研究[J]. 解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，21（2）：94-96. [Tang X M，Gao Z X. 2003. Preliminary application of gene chip to rapid detection of common pathogens in water[J]. Journal of Preventive Medicine of Chinese People’s Liberation Army，21（2）：94-96.]

肖翔，官春云，尹明智，李栒，官梅. 2012. 基因芯片技術(shù)在農(nóng)業(yè)中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，28（33）：187-193. [Xiao X，Guan C Y，Yin M Z，Li X，Guan M. 2012. Research progress on application of gene chip in agriculture[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，28（33）：187-193.]

薛輝，曹尚銀，李好先，牛娟，張富紅，趙弟廣. 2015. 轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在果樹(shù)研究中的應(yīng)用[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，27（5）：16-21. [Xue H，Cao S Y，Li H X，Niu J，Zhang F H，Zhao D G. 2015. Application of transcriptome technology in fruit tree research[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，27（5）：16-21.]

楊國(guó)淋，趙松，尹人杰，黃小波，馬銳，張仙，曹三杰，文翼平，伍銳，文心田. 2016. 結(jié)合不對(duì)稱PCR技術(shù)構(gòu)建雞NDV-IBV-ILTV聯(lián)合檢測(cè)基因芯片[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，24（1）：142- 150. [Yang G L，Zhao S，Yin R J，Huang X B，Ma R，Zhang X，Cao S J，Wen Y P，Wu R，Wen X T. 2016. Construction of gene chip for detecting NDV-IBV-ILTV of chicken（Gallus gallus） with asymmetric PCR[J]. Journal of Agricultural Biotechnology，24（1）：142-150.]

朱業(yè)培，王瑋，呂青骎，范巧君，徐幸蓮，周光宏. 2015. 基于基因芯片技術(shù)檢測(cè)6種動(dòng)物源性成分[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，38（6）：1003-1008. [Zhu Y P，Wang W，Lü Q Q，F(xiàn)an Q J，Xu X L，Zhou G H. 2015. Detection of six kinds of animal-derived ingredients using gene chips[J]. Journal of Nanjing Agricultural University，38（6）：1003-1008.]

Al-Khaldi S F，Villanueva D，Chizhikov V. 2004. Identification and characterization of Clostridium perfringens using single target DNA microarray chip[J]. International Journal of Food Microbiology，91（3）：289-296.

Call D R，Brockman F J，Chandler D P. 2001. Detecting and genotyping Escherichia coli O157：H7 using multiplexed PCR and nucleic acid microarrays[J]. International Journal of Food Microbiology，67（1-2）：71-80.

Fodor S P A. 1997. DNA sequencing：Massively parallel genomics[J]. Science，277（5324）：393-395.

González S F，Krug M J，Nielsen M E，Santos Y，Call D R. 2004. Simultaneous detection of marine fish pathogens by using multiplex PCR and a DNA microarray[J]. Journal of Clinical Microbiology，42（4）：1414-1419.

Jung W S，Kim S，Hong S I，Min N K，Lee C K，Paek S H. 2004. DNA probe chip system for multiple detection of food poisoning microorganisms[J]. Material Science and Engineering，24（1-2）：47-51.

Schena M，Shalon D，Davis R W，Brown P O. 1995. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray[J]. Science，270（5235）：467-470.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）