不同生長因子對脂肪干細胞生物學行為的影響

摘要：目的：觀察不同生長因子對脂肪干細胞生物學行為的影響。方法：通過將兔腹股溝白色脂肪組織通過酶消化培養為脂肪干細胞，在培養過程中取第三代細胞分別給予不同生長因子干預，而后觀察脂肪干細胞遷移能力、黏附能力以及增殖能力。結果：Transwell小室法檢測顯示第四組遷移細胞數最多，第4組黏附細胞數量最多，CCK-8結果顯示隨著時間的推移各因子組合吸光度值均明顯上升，其中第四組吸光值遞增幅度最大，各組之間數據差異明顯，具有統計學意義（P<0.O5）。結論：對于不同生長因子對脂肪干細胞生物學行為產生的影響不同。

關鍵詞：不同生長因子；脂肪干細胞；生物學行為

相關研究報道顯示從脂肪組織中提取的脂肪干細胞具有較強的體外擴增、更新、分化能力，由此為內源性骨再生提供了新興種子細胞。而生長因子屬于機體內具有生物活性的細胞外信號分子，可作用與靶細胞表面受體，從而介導靶細胞參與和進行損傷修復[1，2]。目前臨床實驗中與脂肪干細胞生物學行為研究相關的生長因子有血小板源性生長因子AB、轉化生長因子β1以及血管內皮生長因子，既往的臨床研究中顯示以上三種生長因子均有對脂肪干細胞生物學行為干預的最佳質量濃度，其中血小板源性生長因子AB 的最佳濃度值為10ug/L，轉化生長因子β1的最佳濃度值為2ug/L，血管內皮生長因子最佳質量濃度為10ug/L[3，4]。本次實驗通過觀察不同生長因子組合對兔脂肪干細胞生物學行為的影響，從而觀察不同生長因子對脂肪干細胞生理學行為的影響。

1資料與方法

1.1一般資料

本次實驗選取5只3月齡新西蘭大白兔，所有大白兔均為雌性，體重在2.0～2.5kg，平均體重在（2.2±1.2）kg，5只新西蘭大白兔均生命體征平穩，一般資料上數據不存在明顯差異性（P>0.05）

1.2方法

1.2.1脂肪干細胞培養

嚴格按照無菌操作切取新西蘭大白兔腹股溝白色脂肪組織，將收集的脂肪組織置于雙抗D-Hank's溶液中，剝離脂肪組織中筋膜以及毛細血管而后將脂肪組織剪碎置于15 mL離心管中，在離心管中加入2倍體積濃度0.2%的I型膠原酶，在恒溫搖床上持續消化振蕩半小時，恒溫床保持37攝氏度，最后加入等體積a-MEM培養基中和消化。用200目的細胞篩網過濾脂離心試管中的消化液，而后按照1000 r/min的轉速離心10分鐘，去除試管中懸液再次加入等體積a-MEM培養基，充分混合后接種在25 cm2細胞培養瓶，將其置入細胞培養箱中進行培養，24小時后更換細胞培養基，此后每3天更換1次待細胞長滿瓶底80%左右時用濃度為0.25%的胰酶消化按照1：3的比例進行傳代培養，取第3代脂肪干細胞用于實驗。

1.2.2成骨誘導

將收集的生長狀態良好的第3代脂肪干細胞以3x107 L-1的濃度接種于經0.1%明膠涂料處理的6孔板中，每孔加入2 mL細胞培養基置于培養箱中培養24小時后每孔中加入2 mL成骨誘導液，每3天換以此誘導液，連續誘導21天后用PBS清洗后采用40 g/L多聚甲醛固定，茜素紅染色，將成骨細胞置于顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3成脂誘導

將收集的生長狀態良好的第3代脂肪干細胞以2.1 x107 L-1的濃度接種于6孔板中，置于細胞培養箱中培養且常規換液，待細胞長滿瓶底后將細胞培養基換成脂誘導液A，誘導液A中含有雙抗α-MEM培養液，濃度為200umol/L的吲哚美辛、濃度為1umol/L的地塞米松，濃度為10mg/L的胰島素、濃度為0.5mmol/L的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤持續誘導3天后換保持液B，保持液B中含雙抗的a-ME M培養液、濃度為10mg/L胰島素持續培養1天后再換用誘導液A誘導，如此重復4此后用成脂誘導液A誘導5天，用油紅O染色觀察拍照。

1.2.3不同生長因子實驗研究

將生長良好的第三代脂肪干細胞用濃度為0.25%胰蛋白酶消化吸收后收集貼壁細胞，將其置于濾膜孔徑為8um的24孔Transwell小室進行兔脂肪干細胞遷移性研究，在將每孔密度利用不含有胎牛血清的a-MEM培養液制成1X105個細胞懸液，每孔越600uL，在此基礎上第一組給予最佳濃度轉化生長因子β1以及最佳濃度血小板源性生長因子AB，第二組給予最佳濃度血小板源性生長因子AB以及最佳濃度血管內皮生長因子，第三組給予最佳濃度轉化生長因子β1以及最佳濃度血管內皮生長因子。第四組給予最佳濃度轉化生長因子β1、最佳濃度血小板源性生長因子AB以及最佳濃度血管內皮生長因子，并設置空白對照組，對照組未給予血清培養液，將其進行組織培養，而后倒置熒光顯微鏡觀察五組不同生長因子兔脂肪干細胞遷移細胞數，黏附細胞數以及酶聯免疫檢測中各組吸光值的變化情況。

1.3統計學處理

采用SPSS18.0系統軟件統計分析資料；其中計量資料用（x±s）表示，并用t檢驗；P<0.05表示有統計學意義。

2結果

2.1 成骨誘導結果

在倒置顯微鏡下觀察可見兔脂肪干細胞在成骨誘導第4天左右出現形態變化，逐漸由長梭形變為立方形或矮柱狀，誘導1周兔脂肪干細胞細胞外基質出現晶體狀沉淀，且隨著誘導時間的延長晶體狀沉淀物逐漸增多，持續成骨誘導21天后茜素紅染色發現鈣結節形成（如圖A）

2.2成脂誘導結果

兔脂肪干細胞成脂誘導第4天左右出現形態變化，由長梭形漸變為多邊形或類圓形，隨著成脂誘導時間的延長兔脂肪干細胞胞質內脂脂滴類似物逐漸增多，成脂誘導21天后油紅O染色發現胞質內出現大脂滴（圖 B）。

圖A兔脂肪干細胞成骨細胞誘導 圖B兔脂肪干細胞成脂細胞誘導

2.3不同組合生長因子脂肪干細胞體外遷移情況

Transwell小室脂肪干細胞體外遷移實驗，具體情況（見表1），第四組遷移細胞數最多。

2.4不同組合生長因子脂肪干細胞黏附情況

不同組合生長因子脂肪干細胞黏附情況，具體情況（見表2），第4組黏附細胞數量最多。

3討論

近些年口腔種植修復技術不斷發展，臨床研究發現需要進行口腔種植修復的患者骨量不足可稱為影響個體口腔種植修復效果的制約因素，針對個體骨量不足如何有效促進內源性骨再生已經成為臨床研究的熱點問題之一，其中種子細胞、生長因子以及纖維支架是影響骨再生重塑的關機鍵要素。內源性骨細胞再生依賴于種子細胞在生長因子的誘導下發生分化、遷移、黏附和增殖，從而達到促進骨組織再生修復的目的[5]。近些年臨床研究發現干細胞在遷移、分化、繁殖前需降解細胞外基質以及基地膜，而基質金屬蛋白酶可有效降解細胞外基質，從而調節干細胞基質，促使干細胞基質處于動態平衡狀態。生長因子可通調節基質金屬蛋白酶的表達，從而達到提高干細胞遷移能力的目的[6]。本實驗通過體外觀察不同生長因子組合對兔脂肪干細胞生物學行為的影響，從而篩選出最佳因子組合。本次實驗結果顯示給予最佳濃度轉化生長因子β1、最佳濃度血小板源性生長因子AB以及最佳濃度血管內皮生長因子的生長因子組合其遷移細胞數最多，黏附細胞數量最多，CCK-8結果顯示隨著時間的推移其因子組合吸光度值遞增幅度最高。

綜上所述，本次實驗研究初步認為聯合10ug/L血小板源性生長因子AB，2ug/L轉化生長因子β1以及10ug/L血管內皮生長因子最佳質量濃度可有效促進脂肪干細胞遷移、黏附和增殖。

參考文獻：

[1]高潔，王明國，楊帥等.不同生長因子對脂肪干細胞生物學行為的影響[J].中國組織工程研究，2015，19（19）：3010-3016.

[2]陳猶白，張啟旭，Charles E.Butler等.血管內皮生長因子基因轉染的人脂肪干細胞具有較強的增殖和分化能力[J].細胞與分子免疫學雜志，2017，33（3）：352-356，361.

[3]朱夢琳，姜南，徐揚陽等.堿性成纖維細胞生長因子影響脂肪干細胞的血管內皮遷移[J].中國組織工程研究，2014，6（10）：1573-1578.

[4]亢婷，王剛，劉毅等.改性絲素蛋白支架與生長因子基因修飾脂肪間充質干細胞構建組織工程脂肪[J].中國組織工程研究，2014，23（52）：8450-8455.

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[6]方漢軍，李鋒華，許成等.轉化生長因子β1基因沉默脂肪干細胞移植對鹽敏感性高血壓大鼠心肌纖維化和心肌細胞的影響研究[J].實用心腦肺血管病雜志，2017，25（21）：58-65.