細胞培養工藝的放大及規?？s小模型的建立

摘要：本文以表達單克隆抗體的CHO細胞為研究對象，采用產物表達和產品質量均有一定保證的細胞流加培養工藝在2 L反應器和200 L反應器進行了放大和縮小的實施，建立了放大和縮小模型及策略，為穩定、可靠的生產單克隆抗體藥物提供數據支持。

關鍵詞：細胞培養；放大和縮小

引言：抗體藥物的大規模生產都是在大規模反應器上進行的，當前國內的反應器規模一般為200 L、500 L的中試規模，1000 L和5000 L的生產規模，而國外大規模生產的反應器達到了15000 L規模。培養工藝的反應器放大，一直以來都是工業界具有挑戰性的工作。一方面，如何從小反應器放大至大型反應器在當今工業界仍是較為復雜和困難的。據文獻報道，大型反應器由于混合和傳質效果下降會引起二氧化碳排除變差[1-3]、混合時間變長等現象[4]，進而導致小規模反應器建立的培養工藝放大至生產規模時會出現細胞密度降低[5]、培養周期縮短、產量大幅下降[3]或者產物質量難以控制等一系列問題[6]。對反應器工藝的放大提出了較大的挑戰。另一方面，近年來隨著質量源于設計（Quality by Design，QbD）的理念[7]在生物制藥領域的推廣和應用[8]，越來越多的企業開始在工藝的開發階段應用QbD的理念。因此如何穩定可靠的進行大規模生產，這就使得需要建立合適的規?？s小模型，并在規?？s小模型上對過程工藝參數進行研究，確定參數對CQA的影響，從而明確工藝參數的控制范圍，對于大型反應器的穩定可靠的生產有著十分重要的意義。

1流加培養工藝的規模放大與縮小

1.1操作參數的放大與縮小

細胞培養過程參數可以分為兩類：與體積相關的參數和與體積無關的參數。其中pH、DO和溫度不隨反應器尺寸發生變化，因此這些參數的在放大和縮小過程中保持一致即可。而通氣速率和攪拌轉速則在放大過程中會發生變化。

隨著反應器體積的變大，通氣速率也一般呈直線上升的趨勢。空氣流速的放大一般采用單位體積單位時間的通氣量（vvm）恒定的方法。O2和CO2流速的放大方法和空氣流速的放大方法相似，但是在實際的操作過程中還要根據反應器中O2和pH控制器的類型以及控制策略做適當的調整。更為重要的一點是，在通氣過程中要保持O2和CO2線路的壓力大于空氣線路的壓力，確保O2和CO2能夠進入到鼓泡器中。

反應器攪拌轉速的放大和縮小通常是十分困難的[5]。大型反應器的攪拌速度一方面能夠為反應器提供足夠的混合能力，另一方面還要避免引入由于高轉速和高通氣速率條件下所引起的細胞損傷。此外，在放大和縮小過程中轉速對體積氧傳遞系數（kLa）的影響也要做一定的評估。

1.2流加參數的放大與縮小

在流加培養過程中，流加培養基補入的時間通常是和小規模反應器保持一致，是與體積無關的參數。由于反應器規模的不同，流加體積和流加速率等參數則需要根據培養體積放大倍數需要做一定的調整。此外，在大規模反應器的流加培養過程中，培養體積會隨著流加培養基的補入而不斷的增大，導致培養基的濃度會出現一定程度的稀釋，因此對流加培養基的濃度也應當做一定的考慮。

1.3取樣參數的放大與縮小

不同培養規模下的取樣時間和取樣體積也應當在放大的過程中予以考慮。特別是在小規模的反應器中，每次取樣都會導致培養體積的減少，如果沒有考慮到體積的下降，在流加過程中勢必會導致補入的流加培養基的濃度變大。因此，在制定放大策略時，由于取樣所造成的小規模反應器體積減少量也應當仔細的計算在內。

1.4規模放大和縮小過程中存在的問題

對于哺乳動物細胞大規模培養而言，從實驗室規模放大到生產規模仍然是一個相當大的挑戰[9，10]。在反應器規模放大過程中，當前研究主要集中在流體的剪切力、氧傳遞[11]、溶解二氧化碳的移除[1-3]以及反應器的混合特性[4]四個方面，這些問題已經成為哺乳動物細胞在放大過程中公認的技術難題，是規模放大過中導致生產能力下降的主要原因[6]。

2實驗設計

2.1反應器放大和縮小策略

反應器放大和規模縮小模型的建立采用以下策略：

1.非體積相關的參數保持不變，如pH、DO等

2.體積相關的參數（線性），如培養體積、流加量等

3.體積相關的參數（非線性），如轉速、通氣量等

2.3實驗方法

流加培養方法不變，培養至第3、5、7、9、11天時，每次流加初始培養體積5% 的FeedCPlus，以及1 g/L的Yeast水解物（總量為5 g/L）；每天根據葡萄糖濃度檢測結果，在葡萄糖低于2.5 g/L時，補加葡萄糖濃縮液至濃度4 g/L。培養收獲時間設定為14天。

200 L反應器培養四批，2 L反應器培養7批，對200 L和2 L反應器的培養結果進行對比分析。

2.4大型反應器與小型反應器培養結果的統計學對比

對大型反應和小型反應器的結果進行等效性檢驗。傳統的t檢驗適用于檢驗數據的不同，并不適用于檢驗數等效。對于t檢驗而言，假設二者數據相同，通過拒絕原假設來證明二者是有統計學差異的，如果是接受原假設只是表明沒有足夠的數據來證明而這時有差異的，并不能表明而這是相等的。等效性檢驗使用了兩個方向的單側檢驗，因此也稱為雙向單側檢驗（TOST）。公式定義為 -θ <μS-μL<θ，μS和μL分別表示小規模和大規模反應器的過程參數。如果二者之間的差異落在[-θ，θ]之間表明二者之間是等效的，通產差異在3σ之間人為是可接受的，因此本文的可接受范圍設置為[-3σ，3σ].

3實驗結果與討論

3.1反應器規模放大與縮小

3.1.1細胞生長

圖1.1所示為流加培養工藝在2 L和200 L反應器的細胞生長和活率對比。在細胞生長方面，除第四天200 L反應器的細胞密度高于2 L反應器外，2 L規?？s小系統與200 L反應器基本一致。在細胞活率方面，與200 L反應器相比2 L反應器的細胞活率略低，但一直維持在95%以上。

3.1.2細胞代謝

圖1.2所示為流加培養工藝在2 L和200 L反應器的代謝副產物乳酸生成情況對比。由圖可知，2 L和200 L反應器的乳酸代謝情況基本一致，從第0天到第4天為乳酸生成階段，此階段乳酸快速生成，第四天達到最高為1.7 g/L左右，之后進入乳酸消耗階段，到第10天左右乳酸完全耗光。

圖1.3所示為流加培養工藝在2 L和200 L反應器的代謝副產物氨生成情況對比。由圖可知，整個培養過程中氨都是持續生成的，且從第6天開始，2 L反應器的氨的累積要高于200 L反應器。到最終培養結束時2 L反應器的氨達到14.5 mmol/L，是200 L反應器的1.25倍。2 L反應器的氨的代謝情況與200 L反應器不一致，表明不同反應器規模下對細胞的代謝情況有一定的影響。

3.2蛋白表達

圖1.4所示為流加培養工藝在2 L和200 L反應器的蛋白表達情況對比。由圖可知，2 L和200 L反應器的蛋白表達情況基本一致，培養結束時產量均在2.7 g/L左右。

3.3蛋白質量

圖1.5所示為2 L和200 L反應器上的抗體SEC純度對比，由圖可知，不同規模反應器的抗體SEC純度與搖瓶相比無顯著差異，最終蛋白純度均在98%左右。

圖1.6所示為2 L和200 L反應器上的抗體電荷異質性對比，由圖可知，2 L反應器的抗體的酸峰、堿峰和主成分與搖瓶相比無顯著差異，酸峰比例在12%左右，堿峰比例在16%左右，主成分比例在70%左右。

綜上所述，從2 L和200 L反應器，細胞在生長、活率、乳酸代謝、蛋白表達和蛋白質量方面基本一致，在氨代謝方面2 L反應器的氨的累積要高于200 L反應器。表明該流加培養工藝能夠穩定的放大至實驗室規模的反應器中。

3.4等效性檢驗

對培養過程中的關鍵過程參數進行等效性檢驗。由表1.5可知2 L和200 L反應器的關鍵過程參數是等效的，表明反應器的規模放大和縮小是一致。

4小結

本文首先對2 L反應器和200 L反應器進行分析建立了規模放大和縮小的策略，并在2 L和200 L反應器上進行了實施，進一步對關鍵過程參數進行了等效性檢驗，結果表明2 L反應器和200 L反應器是等效的。

首先，對2 L反應器和200 L反應器進行分析建立了規模放大和縮小的策略，將放大參數分為非體積相關的參數和體積相關的參數兩大類。非體積相關的參數在放大和縮小的過程中保持不變。體積相關的參數又分為線性相關和非線性相關的參數，對于非線性相關的參數采用合適的放大準則。

其次，在2 L反應器和200 L反應器進行了放大和縮小的實施，結果表明細胞在生長、代謝、蛋白表達和蛋白質量方面基本一致。

最終，采用統計學的方法證明了200 L反應器和2 L反應器是等效一致的。

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