花生基因的克隆、序列分析與載體構建

王云云++孫全喜+王秀貞++唐月異++吳琪 張青云 曹廣英 祁雪 張君 王傳堂

摘要：脫落酸（ABA）在植物生長發育中起著重要的作用，9-順式環氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因（NCED）是其合成途徑中的關鍵基因。采用逆轉錄PCR（RT-PCR）技術在花生種子中克隆到其同源基因[WTBX][STBX]AhNCED1，預測該基因開放閱讀框為1 806 bp，編碼601個氨基酸，蛋白質的分子質量為66.8 ku，等電點為8.49。通過生物信息學分析表明，該基因含有2種跨膜區，但均不明顯；由17個絲氨酸、8個蘇氨酸、5個酪氨酸參與磷酸化過程；同源比較發現，該基因與來自擬南芥、柱花草等的NCED具有較高的同源性，進化分析表明該基因與柱花草NCED的親緣關系最近。筆者成功構建了該基因的亞細胞定位載體[WTBX][STBX]AhNCED1-GFP和超表達載體pCambia2300EC-[WTBX][STBX]AhNCED1，為進一步研究花生中[WTBX][STBX]AhNCED1基因的功能奠定了基礎。

關鍵詞：花生；[WTBX][STBX]AhNCED1基因；生物信息學；載體構建

中圖分類號：Q782；S565.201文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2017）03-0020-04

收稿日期：2015-12-22

基金項目：國家花生產業技術體系（編號：CARS-14）；山東省農業科學院青年科研基金（編號：2016YQN17、2015YQN13）；山東省農業科學院重大科技成果培育計劃（編號：2014CGPY09）。

作者簡介：王云云（1989—），女，內蒙古烏蘭察布人，碩士研究生，主要從事花生生物技術等研究，E-mail：13001661900@163.com；共同第一作者：孫全喜（1983—），男，山東章丘人，博士，副研究員，主要從事花生遺傳改良等研究，E-mail：sunqx1983@163.com。

通信作者：王傳堂，博士，研究員，主要從事花生分子育種等研究，E-mail：chinapeanut@126.com；張君，博士，教授，主要從事花生生物技術等研究，E-mail：zhangjun@jlau.edu.cn。

花生栽培種（Arachis hypogaea L.），別稱落花生，是我國重要的油料和經濟作物，在油料生產和國際貿易中占有舉足輕重的地位。與油菜、芝麻、向日葵等油料作物相比，花生的單產、總產量和出口量均居首位[1]。

脫落酸（ABA）是以異戊二烯為基本單位的一種十五碳類倍半萜類植物激素，因能促進葉片脫落而得名[2]。ABA在植物生長發育中起著重要的作用，如促進器官脫落、促進種子成熟和休眠、抑制種子萌發等。9-順式環氧類胡蘿卜素雙加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，簡稱NCED）是ABA生物合成途徑中的關鍵酶。第1個NCED基因在玉米ABA缺失突變體vpl4中被克隆[3]，隨后研究人員在其他植物，如番茄[4]、菜豆[5]、擬南芥[6]、柱花草[7]中克隆了NCED基因。豆類作物中pvNCED基因的表達能延緩種子的萌發[8]。馬鈴薯（Solanum tuberosum）中leNCED基因的過量表達能提高ABA的含量，同時增強種子休眠性[9]。陳靜等通過熒光定量PCR分析表明，在休眠和無休眠種子吸漲萌發過程中，[WTBX][STBX]AhNCED2對于維持種子休眠發揮了積極作用[10]。

本研究在花生X-166種子中克隆到ABA合成途徑中關鍵基因[WTBX][STBX]AhNCED1，用系統發育樹分析與柱花草的親緣關系。通過多種生物在線工具分析該基因的跨膜區。筆者擬構建該基因的亞細胞定位載體[WTBX][STBX]AhNCED1-GFP和超表達載體pCambia2300EC-[WTBX][STBX]AhNCED1，為研究該基因的細胞定位情況和在花生種子休眠中的作用奠定基礎。

1材料與方法

1.1植物材料、質粒及載體

本試驗所用植物材料花生X-166[11]由山東省花生研究所提供；pCambia1390-eGFP，由山東省水稻研究所謝先芝研究員饋贈；植物表達載體pCambia2300EC（添加了35S啟動子及Tnos終止子的pCambia2300載體），由山東農業大學亓寶秀教授饋贈。

1.2方法

1.2.1[WTBX][STBX]AhNCED1基因序列的獲得及PCR擴增利用花生[WTBX][STBX]NCED1 mRNA序列（GenBank登錄號：AJ574819.2），根據預測基因的開放閱讀框（ORF），用DNAClub設計含酶切位點SacⅠ的引物F1、R1（表1）。花生種子RNA的提取，用ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）進行反轉錄，獲得單鏈cDNA，利用PCR對該基因的開放閱讀框進行擴增。其中PCR反應體系：10 μL 5×HF Buffer，2 μL 10 mmol/L dNTPs Mix，2 μL引物F1，2 μL引物R1，0.6 μL二甲基亞砜（DMSO），0.2 μL高保真酶Phusion（New England Labs），1 μL模板，32.2 μL ddH2O。PCR反應程序：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min，30次循環；72 ℃ 10 min。用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳結束后，切取含目的條帶的凝膠，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]回收PCR產物。將回收產物與pEASY-Blunt simple載體（北京全式金生物技術有限公司）連接、熱激法轉化大腸桿菌DH5α（北京全式金生物技術有限公司），將陽性克隆送上海桑尼生物科技有限公司測序。

1.2.2花生[WTBX][STBX]AhNCED1基因的生物信息學分析利用DNAMAN序列分析軟件構建系統發育樹；利用ExPASy ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質的分子量、等電點；利用TMpred（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED form.html）進行跨膜分析；利用NetPhos 2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）、SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）分析蛋白質磷酸化位點和結構。

1.2.3用于亞細胞定位載體的改造以含綠色熒光蛋白（GFP）的質粒pCambia1390-eGFP稀釋物為模板，根據序列設計引物F2、R2（表1），將得到的片段連接到克隆載體pEASY-blunt simple上，得到質粒pEASY-GFP。參照質粒小提試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]說明步驟，提取pEASY-GFP、pCambia2300EC質粒。通過限制性內切酶KpnⅠ、SacⅠ分別對pEASY-GFP和植物表達載體pCambia2300EC進行酶切，回收目的片段、載體片段，用連接酶Solution Ⅰ[寶生物工程（大連）有限公司]于16 ℃過夜連接，熱激法轉化大腸桿菌感受態DH5α，挑取單菌落進行PCR和酶切鑒定，獲得帶有GFP基因的載體pCambia2300EC-GFP。

1.2.4花生[WTBX][STBX]AhNCED1基因亞細胞定位載體構建參照質粒小提試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]說明步驟，提取pEASY-[WTBX][STBX]AhNCED1、pCambia2300EC-GFP質粒，利用限制性內切酶SacⅠ對兩者進行單酶切，對pCambia2300EC-GFP酶切時進行去磷酸化處理，回收目的片段、載體片段，使用連接酶Solution Ⅰ[寶生物工程（大連）有限公司]進行16 ℃過夜連接，用熱激法轉化大腸桿菌感受態DH5α，挑取單菌落進行PCR和酶切鑒定，獲得帶有[WTBX][STBX]AhNCED1基因的亞細胞定位載體[WTBX][STBX]AhNCED1-GFP。

1.2.5花生[WTBX][STBX]AhNCED1基因超表達載體構建參照質粒小提試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]說明步驟，提取pCambia2300EC質粒。利用限制性內切酶SacⅠ對植物表達載體pCambia2300EC進行酶切，同時進行去磷酸化處理，回收載體片段，使用連接酶Solution Ⅰ[寶生物工程（大連）有限公司]將“1.2.4”節中回收的目的片段與該載體片段于16 ℃進行過夜連接，熱激法轉化大腸桿菌感受態DH5α，挑取單菌落進行PCR和測序鑒定，獲得帶有[WTBX][STBX]AhNCED1的植物表達載體pCambia2300EC-[WTBX][STBX]AhNCED1。

2結果與分析

2.1花生[WTBX][STBX]AhNCED1基因的克隆

以ORF兩側設計的引物F1、R1進行PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳后得到約為1 800 bp的片段（圖1），與預期結果一致。測序結果利用DNAMAN軟件分析得到長度為 1 806 bp 的ORF，編碼601個氨基酸。將該基因推導的氨基酸序列與[WTBX][STBX]AhNCED1（登錄號：CAE00459.2）進行比對分析，兩者的同源相似性為99%，證實該序列為花生NCED基因片段，名稱為[WTBX][STBX]AhNCED1。將該基因的氨基酸序列在美國國立生物技術信息中心（NCBI）網站上進行在線BLASTp分析，表明該氨基酸序列與其他植物的NCED氨基酸有較高的相似性，它與柱花草（Stylosanthes guianensis，AAY98512.2）的相似性為93%，與檸條錦雞兒（Caragana korshinskii，ACU86971.1）的相似性為78%，與鷹嘴豆（Cicer arietinum，BAM72560.1）的相似性為74%，與豌豆（Pisum sativum，BAC10550.1）的相似性為74%，與擬南芥（Arabidopsis thaliana，NP_193569.1）的相似性為63%。利用DNAMAN軟件進行系統發育樹分析，結果見圖2。

2.2蛋白質性質預測

采用ExPASy ProtParam預測蛋白質性質，結果顯示，AhNCED1蛋白的理論分子質量為66.8 ku，理論等電點為 8.49，分子式為C2985H4665N813O880S25，原子數為9 368個，帶負電荷氨基酸（Asp+Glu）數69個，帶正電荷氨基酸（Arg+Lys）數74個，脂溶系數為75.12，總平均親水性（GRAVY）為-0.389。用TMpred工具預測蛋白的跨膜區和跨膜方向，結果表明，228至261位氨基酸處可能有1個由內向外的跨膜區，在225至256位氨基酸處可能有1個由外向內的跨膜區，這2種跨膜區均不明顯（圖3）。

2.3蛋白質結構的預測

利用NetPhos 2.0 Server在線工具預測磷酸化位點，結果表明有17個絲氨酸（serine，簡稱S）、8個蘇氨酸（threonine，簡稱T）、5個酪氨酸（tyrosine，簡稱Y）參與磷酸化過程（圖4）。用SWISS-MODEL預測蛋白質三級結構（圖5），結果顯示，AhNCEDI蛋白的Qmean 4為-4.06。

2.4[WTBX][STBX]AhNCED1-GFP載體構建

[CM（24]以含GFP的質粒稀釋物為模板，通過PCR擴增獲得約[CM）]

[TPWYY4.tif][FK）]

[FK（W12][TPWYY5.tif][FK）]

760 bp的片段。將帶有GFP的克隆載體pEASY-GFP與植物表達載體pCambia2300EC同時用限制性內切酶KpnⅠ、SacⅠ進行雙酶切，回收目的片段和載體，并進行連接轉化、菌落PCR鑒定（圖6）。挑選陽性克隆進行測序，同時進行酶切驗證，結果表明，pCambia2300EC-GFP載體構建成功。將帶[JP3]有[WTBX][STBX]AhNCED1的克隆載體pEASY-[JP][WTBX][STBX]AhNCED1、pCambia2300EC-GFP載體同時用SacI進行單酶切，結果見圖7。回收載體片段與目的片段，連接后轉化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆測序，序列分析表明[WTBX][STBX]AhNCED1基因已插入到pCambia2300EC-GFP載體中，表明[WTBX][STBX]AhNCED1-GFP載體構建成功。

[FK（W10][TPWYY6.tif][FK）]

2.5花生[WTBX][STBX]AhNCED1基因超表達載體構建

將帶有[WTBX][STBX]AhNCED1的克隆載體pEASY-[WTBX][STBX]AhNCED1、植物表達載體pCambia2300EC同時利用限制性內切酶SacⅠ進行單酶切，植物表達載體pCambia2300EC酶切結果見圖8，pEASY-[WTBX][STBX]AhNCED1酶切結果見圖7-A。回收目的片段和載體片段，利用連接酶連接后，轉化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆測序。測序結果表明，[WTBX][STBX]AhNCED1片段已準確插入到植物表達載體pCambia2300EC上。

[FK（W25][TPWYY7.tif][FK）]

[FK（W12][TPWYY8.tif][FK）]

3討論與結論

種子缺乏休眠性既可能與種子內源ABA含量低有關，也可能是種子本身對ABA的敏感性降低所致[12]。ABA生物合成基因的過量表達可以增加種子中ABA的含量，從而促進種子休眠或延遲萌發[13]。NCED是ABA合成途徑中關鍵酶。擬南芥中有5個NCED基因，只有[WTBX][STBX]AtNCED6、AtNCED9這2個基因都發生突變的擬南芥種子才能萌發，若只有1個基因突變，種子仍然處于休眠狀態[14]。乙烯利作用下花生種子休眠解除過程中，ABA合成關鍵基因[WTBX][STBX]AhNCED2表達量下調[10]，這表明[WTBX][STBX]AhNCED2在種子休眠中起著重要作用。研究蛋白在細胞中的定位方法主要有融合報告基因定位法、免疫組織化學定位法、蛋白質組學定位技術以及共分離標記酶輔助定位法，其中融合報告基因定位法應用廣泛[15]。本研究在花生中克隆到1個NCED基因，經過生物信息學分析，認為是花生[WTBX][STBX]AhNCED1基因。筆者對其序列進行了分析，并成功構建了該基因的亞細胞定位載體和超表達載體，為深入了解該基因在花生中的功能提供了可能。

[HS2][HT8.5H]參考文獻：[HT8.SS]

[1]單世華，萬書波，邱慶樹，等. 我國花生種質資源品質性狀評價[J]. 山東農業科學，2007（6）：40-42.

[2]郭文雅，趙京獻，郭偉珍. 脫落酸（ABA）生物學作用研究進展[J]. 中國農學通報，2014，30（21）：205-210.

[3]Schwartz S，Tan B，Gage D，et al. Specific oxidative cleavage of carotenoids by VP14 of maize[J]. Science，1997，276（5320）：1872-1874.

[4]Burbidge A，Grieve T，Jackson A，et al. Structure and expression of a cDNA encoding a putative neoxanthin cleavage enzyme （NCE），isolated from a wilt-related tomato （Lycopersicon esculentum Mill.）[J]. Journal of Experimental Botany，1997，48（317）：2111-2112.

[5]Qin X Q，Zeevaart J A. The 9-cis-epoxycarotenoid cleavage reaction is the key regulatory step of abscisic acid biosynthesis in water-stressed bean[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1999，96（26）：15354-15361.

[6]Iuchi S，Kobayashi M，Taji T，et al. Regulation of drought tolerance by gene manipulation of 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，a key enzyme in abscisic acid biosynthesis in Arabidopsis[J]. Plant Journal，2001，27（4）：325-333.

[7]Yang J，Guo Z. Cloning of a 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase gene （[WTBX][STBX]SgNCED1） from Stylosanthes guianensis and its expression in response to abiotic stresses[J]. Plant Cell Reports，2007，26（8）：1383-1390.

[8]Qin X，Zeevaart J. Overexpression of a 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase gene in Nicotiana plumbaginifolia increases abscisic acid and phaseic acid levels and enhances drought tolerance[J]. Plant Physiology，2002，128（2）：544-551.

[9]Thompson A，Jackson A，Symonds R，et al. Ectopic expression of a tomato 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase gene causes over-production of abscisic acid[J]. The Plant Journal，2000，23（3）：363-374.

[10]陳靜，江玲，王春明，等. 花生種子休眠解除過程中相關基因的表達分析[J]. 作物學報，2015，41（6）：845-860.

[11]曲博，關淑艷，王秀貞，等. 34份花生種質休眠性篩選與鑒定[J]. 花生學報，2014，43（2）：50-54.

[12]王傳堂，張建成. 花生遺傳改良[M]. 上海：上海科學技術出版社，2013：336-346.

[13]González-Guzmán M，Abia D，Salinas J，et al. Two new alleles of the abscisic aldehyde oxidase 3 gene reveal its role in abscisic acid biosynthesis in seeds[J]. Plant Physiology，2004，135（1）：325-333.

[14]Lefebvre V，North H，Frey A，et al. Functional analysis of [WTBX][STBX]Arabidopsis NCED6 and [WTBX][STBX]NCED9 genes indicates that ABA synthesized in the endosperm is involved in the induction of seed dormancy[J]. The Plant Journal，2006，45（3）：309-319.

[15]陳婷婷，楊青川，丁旺，等. 紫花苜蓿WRKY轉錄因子基因的克隆與亞細胞定位[J]. 草業學報，2012，21（4）：159-167.