青蒿不同部位總RNA提取方法比較

周敏 付金娥 韋樹根 潘麗梅

摘要：為從青蒿中提取高質量的RNA，以青蒿葉片、莖、根和花為材料，采用TRIzol法、改良TRIzol法、十六烷基三甲基溴化銨-LiCl（CTAB-LiCl）法、CTAB-異丙醇法4種方法，比較不同材料不同方法分離RNA的效果。結果表明，4種方法所提RNA純度均較高，其中改良TriZol法所提RNA質量最好。

關鍵詞：青蒿；RNA提取；改良TRIzol法；蛋白質

中圖分類號： Q522文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）03-0031-02

收稿日期：2015-09-29

基金項目：國家自然科學基金（編號：81560623）；廣西自然科學基金（編號：2013GXNSFAA019221、2013GXNSFBA019180）。

作者簡介：周敏（1991—），女，江西贛州人，碩士研究生，主要從事藥用植物資源育種方面研究。E-mail：zmlww1020@163.com。

通信作者：韋樹根，碩士，副研究員，主要從事藥用植物資源、繁殖、育種等方面的研究。E-mail：weishugen2@163.com。

2015版《中華人民共和國藥典》規定，青蒿為菊科植物黃花蒿（Artemisia annua L.）的干燥地上部分[1]。青蒿苦、辛、寒，具有清虛熱、除骨蒸、解暑熱、截瘧、退黃的功效，多用于治療溫邪傷陰、夜熱早涼、陰虛發熱、骨蒸勞熱、暑邪發熱、瘧疾寒熱、濕熱黃疸等疾病。隨著青蒿素被發現是治療瘧疾的首選藥物，挽救了全球特別是發展中國家數百萬人的生命，使得青蒿一直以來是研究的熱點。目前青蒿的研究不僅從資源、栽培、育種等傳統技術方面進行，還從分子生物學的角度闡明青蒿生長和發育機制及其有效成分青蒿素合成和累積機制等方面進行。因此，提取高質量、高純度、完整性好的RNA是分子生物學研究的重要基礎，對于進行逆轉錄PCR（RT-PCR），cDNA合成、RNA序列分析、Northern印跡雜交等具有重要意義。由于植物組織中化學成分復雜，并沒有一種RNA提取方法適用于所有的植物[2]。青蒿的化學成分主要有揮發油類、香豆素類、萜類、黃酮類、苯丙酸類及其他類成分[3]，復雜的化學成分增加了青蒿RNA提取的難度，且前人也未系統地對青蒿不同部位RNA提取進行研究。本研究通過比較TRIzol法、改良TRIzol法、十六烷基三甲基溴化銨-LiCl（CTAB-LiCl）法和CTAB-異丙醇4種方法提取青蒿不同部位的RNA，不僅進一步地為青蒿進行RT-PCR、cDNA合成、RNA序列分析、Northern印跡雜交等分子生物學試驗提供基礎，還為近緣種植物RNA的提取提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

2015年8月，采集廣西藥用植物園栽培基地的青蒿葉片、莖、花、根等作為試驗材料，立即用液氮速凍后置于 -80 ℃ 冰箱保存備用。

1.2試驗試劑

TRIzol試劑盒、三氯甲烷、異丙醇、三氯甲烷+異戊醇（24 ∶[KG-*3]1）、苯酚、75%乙醇、焦碳酸二乙酯（DEPC）水、CTAB、8 mol/L LiCl、1%瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液。

1.3試驗儀器

主要儀器：Eppendorf移液槍，Sigma Sartorius臺式冷凍離心機，渦旋振蕩儀器，Bio-Rad電泳儀，ChemiDoc XRS凝膠成像系統，MILIPORE超純水機，制冰機（北京長流科學儀器公司），恒溫干燥箱（上海天恒醫療器械有限公司），微量分光光度計，水浴鍋。

1.4操作方法

1.4.1TRIzol試劑盒法

取0.2 g植物組織，在液氮中研磨成細粉，轉移至裝有1 mL TRIzol的1.5 mL離心管中，再加入0.2 mL三氯甲烷顛倒混勻15 s，室溫靜置3 min，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min；取上清液轉移至新的離心管中，加入等體積異丙醇，渦旋混勻，室溫靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，棄上清液，沿試管壁加入1 mL 75%乙醇溶液，4 ℃、8 190 r/min離心5 min，棄上清液，室溫干燥5 min，加50 μL DEPC水溶解。

1.4.2改良TRIzol法

取0.2 g植物組織，在液氮中研磨成細粉，轉移至裝有1 mL TRIzol的1.5 mL離心管中，渦旋振蕩1 min，4 ℃、2 000 r/min離心15 min；取上清液轉移至新的離心管中，加入等體積苯酚+三氯甲烷+異戊醇（25 ∶[KG-*3]24 ∶[KG-*3]1）溶液，渦旋振蕩1 min，室溫靜置3～5 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min；取上清液轉移至新的離心管中，加入等體積的三氯甲烷+異戊醇，室溫靜置3～5 min，4 ℃、12 000 r/min離心 15 min，加入等體積三氯甲烷，室溫靜置3～5 min，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min；取上清液200 μL轉移至新的離心管中，加入 0.5 mL 預冷的異丙醇，顛倒混勻8～10次，室溫靜置8～10 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清液，試管壁加入1 mL 75%乙醇溶液，4 ℃、8 190 r/min離心5 min，棄上清液，室溫干燥5 min，加50 μL DEPC水溶解。

1.4.3CTAB-LiCl法

取0.2 g液氮研磨的樣品迅速轉移至60 ℃預熱的含有600 μL CTAB的離心管中，渦旋振蕩 30 s，于60 ℃水浴2 min，其間顛倒混勻2～3次，室溫冷卻 1 min 后加入等體積三氯甲烷+異戊醇溶液，渦旋振蕩1 min后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min；取上清液，加入等體積的三氯甲烷+異戊醇溶液，渦旋振蕩1 min，4 ℃、12 000 r/min離心 15 min；將上清液轉移至新的離心管中，加入1/3體積的 8 mol/L LiCl，4 ℃過夜沉淀，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，棄上清液，加1 mL 75%乙醇溶液，4 ℃、8 190 r/min離心 5 min，棄上清液，室溫干燥5 min，加50 μL DEPC水溶解。

1.4.4CTAB-異丙醇法

步驟同CTAB-LiCl法，用等體積的異丙醇沉淀。

1.5RNA的質量檢測

用1%瓊脂糖凝膠檢測RNA的純度和完整性，用微量分光光度計檢測RNA的濃度和純度。D260 nm/D280 nm為1.8～20、D260 nm/D230 nm為2.0～2.3，表明RNA樣品純度高。

2結果與分析

2.1TRIzol法提取RNA效果

由圖1、表1可見，電泳結果顯示有3條條帶，且條帶清晰；葉片和根的D260 nm/D280 nm值<1.80，圖1中18S條帶有拖尾，說明RNA已有部分降解。結果表明，用此方法提取的RNA濃度較低。

2.2改良TRIzol法提取RNA效果

由圖2、表2可見，改良TRIzol法電泳可見3條清晰條帶，無拖尾，帶與帶之間無明顯彌散現象；D260 nm/D280 nm值均在1.8～2.1間，說明RNA在整個提取過程中結構完整，未發生明顯降解；D260 nm/D230 nm值均在2.0～2.3間，說明去DNA和蛋白質效果很好。改良后樣品濃度較高，可用于進一步的分子試驗。

2.3CTAB-LiCl法提取RNA效果

由圖3、表3可見，電泳結果有18S、28S條帶，5S條帶模糊，不清晰，不適合用于小RNA的分析，此方法沉淀RNA時，沉淀有顏色，可能是有些物質未去除干凈；其中葉片提取的RNA D260 nm/D280 nm值<1.8，RNA有所降解，說明此方法不適合葉的提取。

2.4CTAB-異丙醇法提取RNA效果

由圖4、表4可見，電泳結果與CTAB-LiCl法相同，5S條帶模糊，不清晰；但用此方法提取的RNA濃度比CTAB-LiCl高，其中花的D260 nm/D230 nm值<2.0，可能有蛋白質殘留或者次生代謝物沒有抽提完全。

3討論

[JP2]組織的破碎程度、RNase的活性、多糖和蛋白質等大分子物質的存在[4]都會影響RNA提取的質量。TRIzol試劑盒法比較簡單方便，耗時也較短，但是可能由于步驟比較簡單，對雜質的去除不夠徹底[5-6]。改良后的TRIzol，加了苯酚，能更好去除蛋白質、多酚、多糖等物質，通過電泳圖、D260 nm/D280 nm值可知，濃度和純度也較高，符合轉錄組、基因克隆等高通量試驗的要求。5S條帶缺失或不清晰是CTAB法提取RNA的不足之處，此方法提取的RNA不能用于小RNA的分析。

LiCl本身沉淀大片段RNA效果好的特點使得到的RNA大片段損失很少，更適于進行后續的分子生物學試驗；而異丙醇沉淀獲得的沉淀體積大，導致多糖和酚類物質的共沉淀作用，因而CTAB-LiCl比CTAB-異丙醇更適合青蒿RNA的提取。因此，青蒿不同部位RNA用TRIzol法提取的比用CTAB法質量更好，條帶清晰、完整，且TRIzol法比CTAB法用時更短，效率更高。[JP]

[HS2*3]參考文獻：

[1]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典：一部[M]. 北京：化學工業出版社，2010.

[2]Loomis W D. Overcoming problems of phenolics and quinones in the isolation of plant enzymes and organelles[J]. Meth Enzymol，1974，31（A）：528-545.

[3]張秋紅，朱子徽，李晉，等. 中藥青蒿化學成分與種植研究現狀[J]. 中國醫藥導報，2011，8（19）：10-12.

[4]Sambrool，J，Fritscli E F，et al. Molecular cloning：a laboratory manuals[M]. 2nd ed. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989：343-361.

[5]賴茜，余迪求. 4種榕樹總RNA提取方法的比較[J]. 云南大學學報（自然科學版），2008，30（6）：636-640.

[6]印華，周兆德，吳志祥. 2種荔枝RNA提取方法的比較[J]. 熱帶農業工程，2009，33（2）：1-4.