野牛草ISSR—PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化與建立

張曉波 翟曉朦 許沛東++趙艷

摘要：根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理探索野牛草[Buchloe dactyloides（Nutt.） Engelm.]ISSR-PCR反應(yīng)體系中各主要成分的最優(yōu)化用量，對(duì)影響野牛草ISSR-PCR反應(yīng)體系的主要因素[dNTP、Taq DNA 聚合酶、引物（Primers）、Mg2+的用量]進(jìn)行優(yōu)化，獲得野牛草的ISSR-PCR最適反應(yīng)體系為20 μL的反應(yīng)體系，包括引物（2.0 μmol/L）4.0 μL、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL、MgCl2（25 mmol/L）1.6 μL、dNTP（2 mmol/L）2.0 μL和模板DNA（20 ng/μL）3.0 μL。該優(yōu)化體系的建立為利用ISSR分子標(biāo)記進(jìn)行野牛草種質(zhì)資源遺傳多樣性研究、種質(zhì)資源鑒定等奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：野牛草；ISSR-PCR；反應(yīng)體系；正交優(yōu)化

中圖分類號(hào)：S688.401文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）03-0033-03

收稿日期：2015-10-06

基金項(xiàng)目：海南大學(xué)青年基金（編號(hào)：qnjj1149）。

作者簡(jiǎn)介：張曉波（1978—），男，山西岢嵐人，博士研究生，副教授，從事草坪管理相關(guān)研究，E-mail：angiaoo@126.com。

通信作者：趙艷。E-mail：yanbo315@126.com。

野牛草[Buchloe dactyloides （Nutt.） Engelm.]為禾本科（Gramineae）畫眉草亞科（Eragrostoideae）野牛草屬（Buchloe）多年生草本植物，由于植株低矮、易繁殖、蔓延快且具有極強(qiáng)的抗旱性，是國內(nèi)外公認(rèn)的典型環(huán)保型草坪草，廣泛用于園林、庭院、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)和固土護(hù)坡的優(yōu)良暖季型草坪[1]。目前，關(guān)于野牛草的形態(tài)特性[2]、坪用性狀[3]、引種繁殖[4]、生態(tài)功能[5]、抗逆性[6-10]等方面研究較多，而對(duì)于野牛草種質(zhì)資源遺傳多樣性評(píng)價(jià)、鑒定等分子水平方面研究報(bào)道較少。

ISSR（inter-simple sequence repeat）是在微衛(wèi)星標(biāo)記（simple sequence repeat，SSR）基礎(chǔ)上發(fā)展起來的分子標(biāo)記，具有揭示的多態(tài)性高、精確度高、檢測(cè)方便的優(yōu)點(diǎn)[11]。目前，廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定、保護(hù)、遺傳多樣性、進(jìn)化及其他分子水平的研究中，如在紫花苜蓿（Medicago sativa）、高羊茅（Festuca ovina）、冰草[Agropyron crstatum （L.） Gaertn.]、黑麥草（Secale cereale L.）等牧草及草坪草的研究中ISSR分子標(biāo)記得到了廣泛應(yīng)用[12]。

盡管ISSR具有許多優(yōu)點(diǎn)，但由于其本質(zhì)還是基于PCR反應(yīng)的一種分子標(biāo)記，不同類型植物的PCR反應(yīng)體系會(huì)具有一定的差異，所以為了ISSR分析結(jié)果的可靠性及可重復(fù)性，在進(jìn)行遺傳多樣性分析等研究之前預(yù)先對(duì)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化非常重要。本研究利用正交設(shè)計(jì)原理對(duì)影響野牛草ISSR反應(yīng)的主要因素[包括引物（Primer）、Taq DNA 聚合酶、Mg2+、dNTP的用量]設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)篩選最優(yōu)反應(yīng)體系；可為野牛草種質(zhì)資源遺傳多樣性評(píng)價(jià)、種源鑒定及明確親緣關(guān)系以及其他方面的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料來源

本試驗(yàn)材料為中坪1號(hào)野牛草種子剝?nèi)シf殼后經(jīng)水培生長到約10 cm的幼嫩植株，采用改良CTAB法提取水培植株基因組DNA，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量及完整性，然后用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定其濃度，根據(jù)檢測(cè)濃度將其稀釋為20 ng/μL后備用。

1.2野牛草ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化

本試驗(yàn)正交設(shè)計(jì)針對(duì)影響野牛草ISSR-PCR反應(yīng)的4個(gè)主要因素引物、Taq DNA 聚合酶、Mg2+及dNTP的用量，利用正交設(shè)計(jì)助手3.1綠色版設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)行4因素3水平篩選最優(yōu)反應(yīng)體系，具體正交設(shè)計(jì)見表1、表2。制備總體積為20 μL的PCR反應(yīng)體系，除各變化因素外，每反應(yīng)管中還含有Reaction Buffer（×10）2.0 μL以及稀釋濃度為20 ng/μL的野牛草模板DNA 2.0 μL，不足20 μL部分用ddH2O補(bǔ)足，引物隨機(jī)選用UBC808（序列為AGA、GAG、AGA、GAG、AGA、GC）。ISSR-PCR反應(yīng)在Biometra Personal Thermal Cycler上進(jìn)行；擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性1 min，然后55 ℃退火1 min，最后72 ℃延伸2 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸6 min。反應(yīng)完成后在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入4 μL上樣緩沖液，使用1×TBE緩沖液，用含有 0.5 g/L 溴化乙錠（EB）的1.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳（5 V/cm），電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3反應(yīng)模板DNA用量篩選

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果確定ISSR-PCR的最佳反應(yīng)體系，并應(yīng)用上述體系中最佳的反應(yīng)組合，同時(shí)為保證結(jié)果的重復(fù)性，隨機(jī)引物仍選用UBC808以及20 μL的PCR反應(yīng)體系，模板DNA（20 ng/μL）設(shè)置用量為1.0～4.5 μL（每梯度增加 0.5 μL）共8個(gè)處理來確定ISSR-PCR反應(yīng)體系中野牛草模板DNA的最適用量。

1.4數(shù)據(jù)處理

利用正交設(shè)計(jì)助手3.1綠色版和Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2結(jié)果與分析

2.1ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化及建立

ISSR-PCR的反應(yīng)結(jié)果與Mg2+、dNTP、引物及Taq DNA 聚合酶的用量4個(gè)因素密切聯(lián)系。在本試驗(yàn)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的9個(gè)擴(kuò)增組合中，由于各組合成分用量的不同，擴(kuò)增結(jié)果有比較明顯的差異，但各組合都可擴(kuò)增出較多的譜帶（圖1）。具體來說，1、2、3號(hào)處理組合除了明顯的3條譜帶較強(qiáng)外，其他譜帶強(qiáng)度比較弱；4、7號(hào)組合譜帶比較清晰，但多態(tài)性相對(duì)較差；6號(hào)組合條帶擴(kuò)增較多，但強(qiáng)度較弱；8、9號(hào)組合除多態(tài)性較低外，也沒有得到最佳的效果。綜合來看，5號(hào)組合條帶多，背景干擾較小。經(jīng)過綜合對(duì)比，以譜帶多態(tài)性高、背景影響低、主帶清晰且副帶明顯為篩選原則，確定5號(hào)組合為野牛草ISSR-PCR的最適反應(yīng)體系，即20 μL的體系中含引物（2.0 μmol/L）4.0 μL、Mg2+（25 mmol/L）1.6 μL、dNTP（2 mmol/L）2.0 μL以及Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL。

[FK（W9][TPZXB1.tif][FK）]

2.2模板DNA用量的確定

由圖2可知，在20 μL的ISSR-PCR反應(yīng)體系中，野牛草DNA模板的用量在1.0～4.5 μL（20 ng/μL）之間時(shí)，8個(gè)梯度的組合均能擴(kuò)增出條帶；但在模板用量較低（1.0～2.5 μL）時(shí)，造成擴(kuò)增條帶的較少。在模板用量為 3.0 μL 時(shí)，譜帶多態(tài)性高；而當(dāng)模板用量超過3.0 μL（3.5～4.5 μL）時(shí)，擴(kuò)增出的譜帶減少。通過全面比較，仍以譜帶多態(tài)性高、背景影響低、主帶清晰且副帶明顯為篩選原則，最后確定反應(yīng)體系中DNA模板最適用量為3.0 μL。

2.3優(yōu)化ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立

根據(jù)L9（34）正交試驗(yàn)以及采用梯度法對(duì)DNA模板用量的篩選結(jié)果，建立野牛草ISSR-PCR最優(yōu)化反應(yīng)體系，總計(jì)20 μL，其組分及各自用量見表3。

3討論與結(jié)論

ISSR是基于PCR反應(yīng)的一種分子標(biāo)記，和其他分子標(biāo)記技術(shù)類似，受到反應(yīng)條件及所分析植物種類的影響，不同類型的植物對(duì)反應(yīng)體系的要求存在較大的差異。為了得到可靠性高及具有可重復(fù)性的分析結(jié)果，對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化非常重要[13-14]。如果采用單因素設(shè)計(jì)對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，則必須分別對(duì)每個(gè)影響因素進(jìn)行多次的梯度試驗(yàn)，過程復(fù)雜繁瑣且無法同時(shí)兼顧各影響因素間交互作用[15-18]；與單因素PCR設(shè)計(jì)比較，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)既具有均衡分散、綜合可比及高效率等特性，又減少了試驗(yàn)的工作量，克服了單因素設(shè)計(jì)的缺點(diǎn)[19-22]，所以利用正交試驗(yàn)對(duì)ISSR-PCR的反應(yīng)體系多因素組合進(jìn)行篩選，可較快地找到最佳組合，從而迅速獲得試驗(yàn)結(jié)果[23-28]。

為了建立ISSR-PCR最優(yōu)化反應(yīng)體系、提高反應(yīng)的穩(wěn)定性及特異性，本試驗(yàn)根據(jù)正交設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，對(duì)影響ISSR擴(kuò)增結(jié)果的關(guān)鍵因素（MgCL2、dNTP、引物、Taq DNA 聚合酶、DNA模板的用量）進(jìn)行篩選，最后獲得適合野牛草ISSR-PCR優(yōu)化反應(yīng)體系，即20 μL的反應(yīng)體系中含有引物（2.0 μmol/L）4.0 μL、DNA模板（20 ng/μL）3.0 μL、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL、Reaction buffer（10×）2.0 μL、MgCl2（25 mmol/L）1.6 μL、dNTP（2 mmol/L）2.0 μL及ddH2O 7.2 μL。

ISSR分子標(biāo)記具有步驟簡(jiǎn)單、迅速穩(wěn)定和多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)，且試驗(yàn)進(jìn)行前不須要獲知植物的基因組背景，廣泛應(yīng)用于品種鑒定、分類、進(jìn)化等方面的研究[13]。本研究中野牛草 ISSR-PCR 反應(yīng)體系的建立，為ISSR-PCR技術(shù)進(jìn)行野牛草種源鑒定、遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系、優(yōu)良性狀標(biāo)記以及其他分子水平的研究奠定了基礎(chǔ)。

[HS2]參考文獻(xiàn)：

[1]孫吉雄. 草坪學(xué)[M]. 3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2008.

[2]胡曉艷，李敏，楊青川，等. 坪用野牛草種質(zhì)資源搜集及品種篩選研究進(jìn)展[J]. 中國草地，2005，27（6）：54-60.

[3]王曉榮. 野牛草遺傳力、配合力的估測(cè)及坪用性狀的觀測(cè)[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

[4]胡曉艷. 野牛草有性繁殖特性及其抗旱轉(zhuǎn)錄因子DREB 的克隆[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2007.

[5]李會(huì)彬，邊秀舉，趙炳祥. 坪用野牛草研究進(jìn)展[J]. 草原與草坪，2005（3）：9-12.

[6]李德穎. 野牛草雌雄單性植株對(duì)水分脅迫反應(yīng)的差異[J]. 園藝學(xué)報(bào)，1996，23（1）：62-66.

[7]康俊梅. 低溫脅迫下野牛草生理生化響應(yīng)及蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2008.

[8]錢永強(qiáng)，孫振元，韓蕾，等. 野牛草葉片活性氧及其清除系統(tǒng)對(duì)水分脅迫的響應(yīng)[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2010，30（7）：1920-1926.

[9]沈靜，楊青川，曹致中，等. 低溫脅迫對(duì)野牛草細(xì)胞膜和保護(hù)酶活性的影響[J]. 中國草地學(xué)報(bào)，2010，32（2）：98-102.

[10]譚玉霞，劉榮堂，王顯國，等. 12份野牛草材料蒸散量及抗旱性的研究[J]. 中國草地學(xué)報(bào)，2010，32（1）：40-47.

[11]Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D.Genome finger-printing by simple sequence repeat （SSR）-anchomd polymerase chain reaction amplification[J]. Genomies，1994，20：176-183.

[12]解新明，盧小良. SSR和ISSR標(biāo)記及其在牧草遺傳與育種研究中的應(yīng)用前景[J]. 草業(yè)科學(xué)，2005，22（2）：30-37.

[13]孫洪，程靜. 詹克慧.ISSR標(biāo)記技術(shù)及其在作物遺傳育種中的應(yīng)用[J]. 分子植物育種，2005，3（1）：123-127.

[14]魏臻武，符昕，耿小麗，等. 苜蓿遺傳多樣性和親緣關(guān)系的SSR和ISSR分析[J]. 草地學(xué)報(bào)，2007，15（2）：118-123.

[15]王瑜，袁慶華. 紫花苜蓿ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J]. 草地學(xué)報(bào)，2007，15（3）：212-215.

[16]王彥華，侯喜林，徐明宇. 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化不結(jié)球白菜ISSR反應(yīng)體系研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2004，24（5）：899-902.

[17]謝運(yùn)海，夏德安，姜靜，等. 利用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化水曲柳ISSR-PCR反應(yīng)體系[J]. 分子植物育種，2005，3（3）：445-450.

[18]王方，袁慶華. 冰草ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J]. 草地學(xué)報(bào)，2009，17（3）：354-357.

[19]袁慶華，張君艷. 苜蓿假盤菌ISSR反應(yīng)體系優(yōu)化及指紋圖譜構(gòu)建[J]. 草地學(xué)報(bào)，2008，16（1）：17-22.

[20]李旻，王四寶，樊美珍，等. 森林生態(tài)系中球孢白僵菌遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 遺傳，2006，28（8）：977-983.

[21]Menzies J G，Bakkeren G，Matheson F. Use of inters simple sequence repeats and amplified fragment length polymorphisms to analyze genetic relationship s among small graininfecting species of Ustilago[J]. Ecology and Population Biology，2003，23（2）：167-175.

[22]Hirst P，Richardson T E，Carson S D，et al. Dothistroma pini genetic diversity is low in New Zealand[J]. New Zealand Journal of Forestry Science，2000，29（3）：459-472.

[23]Burgess T，Wingfield M J，Wingfield B W. Simple sequence repeat markers distinguish among morphotypes of Sphaeropsis sapinea[J]. Applied and Environmental Microbiology，2001，67（1）：354-362.

[24]孫立夫，楊國亭，秦國夫，等. 用ISSR標(biāo)記高盧蜜環(huán)菌系統(tǒng)發(fā)生學(xué)的嘗試[J]. 植物研究，2003，23（3）：317-322.

[25]于紅梅，林英任，陳莉，等. 皮下盤菌屬種內(nèi)及種間遺傳多樣性的ISSR分子標(biāo)記[J]. 微生物學(xué)雜志，2009，29（2）：12-16.

[26]姜占發(fā). 棉花黃萎病菌基因組ISSR分子指紋分析[D]. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

[27]李海蓮. 茄子黃萎病病原菌鑒定及其ISSR分子指紋分析[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[28]楊水英，肖崇剛，韓海波，等. 重慶稻瘟病菌不同菌株DNA指紋圖譜分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，24（3）：235-237.