萊克多巴胺釤標記時間分辨熒光免疫分析方法的建立

摘要：基于抗萊克多巴胺（SAL）的單克隆抗體，初步建立了檢測SAL的高靈敏度時間分辨直接競爭免疫分析法（CD-TRFIA）。采用辛酸-硫酸銨純化抗SAL雜交瘤細胞株腹水單克隆抗體，用稀土離子Sm3+偶聯物進行標記，制備釤標抗體；通過合成SAL-SUC半抗原并與卵清蛋白偶聯獲得SAL-OVA包被抗原；采用直接競爭的方式，游離SAL和固相SAL-OVA包被原共同競爭有限的釤標SAL單抗，初步建立SAL時間分辨免疫分析方法。研究發現，優化的TRFIA半抑制量IC50為1.6 ng/mL，檢測范圍為0.39～12.77 ng/mL，最低檢測限為0.136 ng/mL。

關鍵詞：萊克多巴胺；釤標單克隆抗體；時間分辨熒光免疫分析

中圖分類號： TS207文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）03-0036-05

收稿日期：2016-05-14

基金項目：內蒙古自治區高等學校科學研究項目（編號：NJZC13407）；內蒙古商貿職業學院課題項目（編號：NSZY1113）。

作者簡介：李貞（1980—），男，碩士，講師，主要從事食品加工與營養檢測的教學與研究。E-mail：563983393@163.com。

時間分辨熒光免疫分析（time-resolved fluorescence immunoassay，TRFIA）是20世紀80年代初由Pettersson等創立的一種非放射性標記免疫分析技術，與傳統的熒光素標記不同，它以釤（Sm）、鋱（Tb）、釤（Sm）、鈮（Nd）等三價稀土離子鑭系元素為標記物，代替熒光物質、同位素、酶、化學發光物質，標記抗原、抗體、核酸探針等。這些離子可產生熒光，其熒光不僅強度高，且熒光衰變時間長，利用延緩測量時間，當待測樣品中短壽命的自然熒光衰變后再用TRFIA技術檢測，可消除自然熒光的干擾。

TRFIA技術在食品安全領域的應用研究已逐漸開展[1-5]，在黃曲霉毒素A、黃曲霉毒素B1、醋酸甲羥孕酮、氯霉素等分析中相繼建立起來。關于β-腎上腺素受體興奮劑的TRFIA研究已有報道，其中萊克多巴胺檢測的TRFIA方法研究表明，其檢測限低（0.1 μg/kg），在多種基質中的準確度高、變異系數低，與傳統的ELISA方法比較其相關性好、靈敏度高，表明TRFIA方法用于檢測β-興奮劑類藥物具有廣闊前景[2-3]。萊克多巴胺（ractopamine，SAL）是“瘦肉精”克倫特羅的替代品，作為動物生長促長劑在畜牧生長中濫用的現象非常嚴重，是食品安全檢測的重點監控對象。目前，萊克多巴胺檢測以儀器分析方法為主，研究開發出成本低廉、操作簡便、檢測迅速、靈敏度高的免疫分析檢測技術顯得尤為重要。ELISA作為一種傳統的免疫分析形式，在萊克多巴胺檢測中已有應用報道，但檢測靈敏度有待提高。時間分辨免疫分析作為一種超靈敏的痕量分析手段，在萊克多巴胺檢測中未見報道。本研究以萊克多巴胺單克隆抗體的制備為基礎，建立TRFIA免疫學檢測方法，以開發能夠檢測萊克多巴胺的時間分辨熒光免疫試劑盒。

1材料與方法

1.1儀器設備

U-3010型紫外可見分光光度計（日本Hitachi公司），Wallac VITOR31420型多標記分析儀（美國Thermo公司），Wellwash MK2型洗板機（美國Thermo公司），6K15型冷凍離心機（Sartorius-Sigma公司），82-5型控溫磁力攪拌器（金壇市恒豐儀器廠），DK-8D型電熱恒溫水槽（上海醫用恒溫設備廠），BCD-191W/H型可調數顯冰箱（Kelon公司），特制層析柱（1.5 cm×20 cm）（上海華美儀器設備有限公司），自動收集器（Bio-Rad公司），超低溫高速離心機（Sigma公司），恒溫振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司），微量可調移液槍（吉爾森公司），BP61S型電子天平（瑞士Sartorius公司），96孔微量反應板（雷博公司）。

1.2試劑

萊克多巴胺（含量大于99%）、克倫特羅（含量大于98%）購自美國Dr. Ehrenstorfer公司，羊抗小鼠IgG抗體、牛血清蛋白（98.6%）購自Sigma公司，磷酸二氫鈉（分析純）、乙二胺四乙酸二鈉（分析純）購自天津市化學試劑六廠，磷酸氫二鈉（分析純）購自汕頭市光華化學廠，鄰苯二甲酸氫鉀購自天津市大茂化學試劑廠，新鮮陰性豬尿樣由廣州市獸藥監督所提供。

1.3試劑配制

包被緩沖液/標記物緩沖液（pH值9.6、0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液）[4]：Na2CO3 0.375 g、NaHCO3 0.732 5 g，加蒸餾水定容至250 mL。洗滌緩沖液（pH值7.4 PBST）：KH2PO4 0.4 g、Na2HPO4·12H2O 5.8 g、NaCl 16 g、KCl 0.4 g、0.05% Tween-20 1 mL，加蒸餾水定容至2 000 mL。標記物洗脫液（pH值7.6、1 mol/L Tris-HCl）：Tris-Base 12.12 g、NaCl 9 g，加去離子水定容至1 L，采用6 mol/L HCl將pH值調至7.6。標記物稀釋液：Tris-Base 6.056 g、NaCl 9 g，加去離子水定容至1 L，采用6 mol/L HCl將pH值調至7.6，再加入BSA 2 g、Tween-20 0.3 mL，濾膜過濾除菌。[LM]

1.4試驗動物及細胞株

清潔級Balb/c純種雌性小鼠購自中山醫科大學實驗動物中心。抗萊克多巴胺單克隆雜交瘤細胞株4E4由筆者所在實驗室保存。

1.5SAL包被抗原的合成

參照黃飚等的方法[6]進行SAL包被抗原的合成。

1.6釤標抗體的制備與純化

參照Shen等的方法[7]進行雜交瘤細胞株復蘇及腹水制備，參照Shen等、王永成等的方法[7-8]進行辛酸-硫酸銨沉淀法分離純化抗體，參照王永成等的方法進行Sm3+抗SAL單克隆抗體的制備[8]。

1.7Sm3+標記抗體稀釋倍數與包被濃度估測

1.7.1固相抗原的制備

將SAL-OVA用包被緩沖液稀釋為10.00、5.00、2.50、1.25 μg/mL 4個包被濃度，96孔微孔板中每個包被濃度各包3列，每孔加100 μL，于4 ℃下放置過夜。棄去包被液，用洗滌緩沖液洗板2次，拍干。加120 μL封閉液封閉，于37 ℃下封閉3 h，棄去封閉液，置于37 ℃烘箱中烘干，于4 ℃下密封保存。

1.7.2直接SAL-TRFIA棋盤滴定

將Sm3+標記抗體倍比稀釋為250、500、1 000、2 000、4 000、8 000倍液共6個濃度，固相抗原包被濃度分別為8、4、2、1 μg/mL。96孔酶標板中，每行為1個抗體稀釋濃度，每列為1個包被濃度。加入 50 μL 抗體至預加50 μL抗體稀釋液的酶標孔中，于37 ℃下振蕩反應1 h，洗板6次，拍干；加增強液200 μL，振蕩反應 10 min，采用Wallac VICTOR3 1420型多標記分析儀測量其CPS值。

1.8時間分辨免疫分析方法的建立

1.8.1SAL標準液的配制

采用PBST稀釋液將純度為99%的SAL硫酸鹽配制成濃度為100 μg/mL的母液，稀釋至 1 μg/mL 作為貯備液，使用前配制成濃度梯度為0.000、0.256、0.640、1.600、4.000、20.000、100.000 ng/mL的SAL標準品工作液。

1.8.2直接競爭SAL-TRFIA步驟

添加標品與釤標抗體各50 μL，每孔做1個重復，于37 ℃下振蕩反應1 h，洗板6次，拍干，添加增強液200 μL，振蕩反應10 min，采用Wallac VICTOR3 1420型多標記分析儀測量其CPS值。

1.8.3最佳Sm3+標記抗體稀釋度的確定

按“1.8.2”節估測的包被濃度進行包板，將釤標抗體進行系列稀釋，稀釋倍數分別為350、400、450、500倍，測定各稀釋度熒光計數。以標準點（SAL濃度）為橫坐標，以各稀釋度熒光計數（CPS）與最高濃度熒光計數（CPSmax）的比值為縱坐標，測定熒光值并繪制曲線，確定最佳Sm3+標記抗體稀釋度。

1.8.4最佳包被濃度的確定

取3條96孔微孔板反應條，用包被液對SAL-OVA進行一系列稀釋，濃度為1.50、1.25、1.00 μg/mL，進行包被，按照棋盤滴定初步篩選出的濃度稀釋抗體，按照“1.7.2”節的步驟測定各稀釋度熒光計數。繪制標準曲線，曲線靈敏度較高、曲線斜率較大的抗原濃度即為最適包被工作濃度。

1.8.5最佳競爭時間的確定

將工作濃度稀釋的釤標抗體和SAL標準液加入確定包被濃度的SAL-OVA包被板中，于37 ℃下分別溫育30、60、90、120 min，其他步驟同“1.8.3”節，測定不同競爭時間下的標準曲線。

1.8.6最佳反應體系的確定

在包被好的板條中分別加入標準品50 μL和釤標抗體50 μL（體系1）、標準品100 μL和釤標抗體50 μL（體系2）、標準品50 μL和釤標抗體100 μL（體系3）、標準品100 μL和釤標抗體100 μL（體系4），根據各反應體系的最終反應體積分別加入增強液100、150、200 μL，振蕩10 min，繪制標準曲線，確定最佳反應體系。

1.9SAL-TRFIA方法的標準曲線建立

采用最佳模式的最佳條件操作，用Wallac VIVTOR3 1420型多標記分析儀測定熒光值得到標準曲線，從而確定其IC50與檢測的線性范圍。

1.10SAL-TRFIA方法的靈敏度、精密度和特異性

做SAL為零濃度的孔8個，以零劑量點計數率（CPS）均值減3倍標準差后的計數率在標準曲線上得到的相應濃度值為檢測的靈敏度。以標準曲線制備的板內誤差和板間誤差來表示方法的精密度。以系列濃度的SAL及萊克多巴胺、克倫特羅2種近似抗原分別做競爭抑制曲線，計算各自的結合率，求出各自在IC50時的濃度交叉反應率。

2結果與分析

2.1SAL-OVA包被抗原的制備

通過混合酸酐法合成SAL-SUC-OVA包被原，由紫外掃描后的結果（圖1）可知，SAL-SUC-OVA在280 nm處的吸收值明顯高于OVA和SAL-SUC，從而可確定SAL-SUC已與OVA偶聯成功。

[TPLZ1.tif][FK）]

2.2釤標抗體的制備與純化

經辛酸-硫酸銨沉淀法純化后，腹水抗體濃度為 3.96 mg/mL。經ic-ELISA檢測，純化腹水抗體對SAL具有較強的識別能力，且效價較高。將經過釤標后的抗體利用Sephardex G25（1 cm×40 cm）層析柱純化，進行紫外檢測（圖2）和熒光檢測（圖3）。檢測結果表明，Sm3+標抗體與游離釤的分離度較高，紫外檢測和熒光值檢測的出峰管數與游離釤出峰管數基本相同，第1個峰值是釤標成功的抗體，第2個峰值是游離釤。由圖3可知，21～25管是沒有被游離釤污染的純化釤標抗體，且其熒光計數值均大于40萬。

2.3Sm3+標記抗體反應稀釋倍數與包被濃度

CPSmax值呈現隨包被濃度逐漸增大的趨勢，其中 8 μg/mL 時熒光讀數達到最高值，4、2、1 μg/mL的熒光讀數均較為接近；隨著稀釋倍數的增大，其熒光值下降較快（表1）。[CM（23*2/3]為降低試驗成本和提升檢測效果，應選取CPSmax值在10 000～12 000時，包被濃度和抗體濃度均達最低值的組合，即包被濃度為1 μg/mL，抗體稀釋倍數為500倍。

2.4時間分辨免疫分析方法的建立

2.4.1釤標抗體稀釋倍數的確定

由于釤標抗體制備成本高，先對釤標抗體稀釋倍數進行優化（圖4、圖5）。當包被抗原濃度為1.25 μg/mL時，反應的CPSmax值隨著Sm3+標抗體稀釋倍數的增加而顯著下降，與抗體稀釋倍數相對應，其IC50值分別為3.26、3.84、5.83、5.83 ng/mL。當抗體稀釋倍數為350倍與400倍時，其IC50值相近，靈敏度與其他2個稀釋倍數相比較高。綜合考慮抗體成本和曲線靈敏度，選擇CPS值高的400倍作為最佳抗體稀釋倍數。

2.4.2包被濃度檢測

由棋盤滴定得到的結果可初步得知，包被濃度為1 μg/mL時反應較為理想，進一步設置3個包被濃度（1.00、1.25、1.50 μg/mL）的SAL-OVA進行固相包被，將釤標抗體進行400倍稀釋參與反應。結果表明，3種包被濃度對應的藥物抑制曲線擬合度較好（圖6），差異不大。比較不同包被濃度擬合曲線的CPSmax和IC50發現，CPSmax隨著包被濃度的增加呈上升趨勢，不同包被濃度擬合的曲線IC50有所區別，3個包被濃度對應的IC50分別為3.67、2.43、3.66 ng/mL（圖7）。綜合考慮靈敏度與熒光值， 當包被濃度為1.25 μg/mL時，TRFIA熒光值適中，且其靈敏度較高，因此選取1.25 μg/mL為最佳包被濃度。

2.4.3競爭時間的確定

采用抗原包被濃度1.25 μg/mL、釤標抗體稀釋倍數400倍，探討不同競爭時間（30、60、90、120 min）對靈敏度的影響（圖8、圖9）。標準曲線的CPSmax值隨著競爭時間的延長呈上升趨勢，但其靈敏度并不隨之提高，反應30～120 min的IC50值分別為1.90、1.88、2.83、2.66 ng/mL，由此可知競爭時間過長會導致非特異吸附產生，從而降低分析靈敏度。溫育30 min時其CPSmax值較低，表明在短時間段內抗原抗體反應并不完全；溫育60 min時所對應的CPSmax值適中，且IC50較低，表明競爭反應已經進行充分，基本平衡，因此最佳的競爭時間為60 min。

2.4.4競爭模式的確定

考察4種反應模式對靈敏度的影響。體系1：50 μL SAL+50 μL Sm3+-McAb，共100 μL。體系2：100 μL SAL+50 μL Sm3+-McAb，共150 μL。體系3：50 μL SAL+100 μL Sm3+-McAb，共150 μL。體系4：100 μL SAL+100 μL Sm3+-McAb，共200 μL。

由圖10、圖11可知，體系2、體系3中SAL與釤標抗體的比例分別為2 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]2，IC50值分別為2.11、3.11 ng/mL。體

系2中，由于釤標抗體添加比例低，從低濃度開始藥物便對抗體有較明顯的抑制作用，導致熒光值過低，抑制曲線擬合程度低。體系3中，釤標抗體添加比例高，CPSmax適中，但藥物比例低，藥物對抗體抑制不充分，因此靈敏度較低。而體系1、體系4的SAL與釤標抗體是等量的，競爭反應完全，體系總體積相異，靈敏度有明顯差異，反應體系增大導致靈敏度下降。選取釤標抗體與藥物等量且釤標抗體添加量少、反應靈敏度高的體系1為最佳反應體系。

2.5SAL-TRFIA方法的標準曲線建立

按照優化方案的結果，包被抗原直接競爭TRFIA法的最優化條件為：釤標稀釋400倍、包被濃度1.25 μg/mL、反應時間1.0 h、反應體系為體系1。按照最優條件，標準品的濃度為0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 ng/mL時，建立SAL時間分辨免疫分析方法的標準曲線（圖12）。曲線線性好，其中半抑制量（IC50）為1.6 ng/mL，最低檢測限（IC10）為 0.136 ng/mL，檢測范圍（IC20～IC80）在0.39～12.77 ng/mL。

2.6SAL-TRFIA方法的精密度和特異性

取6個不同濃度的SAL標準溶液進行時間分辨分析，每個濃度設8個重復孔，進行精密度測試（表2）。由表2可知，板內、板間的平均差異均在15%以內，表明建立的TRFIA方法精密度良好、穩定性高。

利用藥物萊克多巴胺、克倫特羅，采用所建立的萊克多巴胺釤標記時間分辨熒光免疫法進行交叉反應。結果顯示，與克倫特羅的交叉較小，僅有 2.29%，而與萊克多巴胺基本沒有交叉，表明基于抗SAL-單克隆抗體的TRFIA特異性良好。[JP]

2.7SAL-TRFIA方法的準確性

各取豬肉、豬肝、豬尿、飼料樣品3份，分別加入高、中、低濃度的藥物進行準確性試驗（表3）。由表3可知，TRFIA方法測定SAL在豬肉、豬肝、豬尿、飼料4種基質中的平均加標回收率分別為98.02%、96.03%、108.73%、106.09%，基本在80%～120%之間。

3結論與討論

萊克多巴胺（SALbutamol，SAL）是“瘦肉精”克倫特羅的替代品，作為動物生長促長劑在畜牧生產中濫用的現象非常嚴重，是食品安全檢測的重點監控對象。[JP+1]目前，萊克多巴胺檢測以儀器分析方法為主，研究開發成本低廉、操作簡便、檢測迅速、靈敏度高的免疫分析檢測技術顯得尤為重要。ELISA作為一種傳統的免疫分析形式，在萊克多巴胺檢測中的應用已有報道，但檢測靈敏度有待提高。時間分辨免疫分析作為一種超靈敏的痕量分析手段，在萊克多巴胺檢測中未見報道。[JP]

本研究基于抗SAL的單克隆抗體，初步建立了檢測SAL的高靈敏度時間分辨直接競爭免疫分析法（CD-TRFIA）。采用辛酸-硫酸銨純化抗SAL雜交瘤細胞株腹水單克隆抗體，用稀土離子Sm3+偶聯物進行標記，制備釤標抗體；通過合成SAL-SUC半抗原并與卵清蛋白偶聯獲得SAL-OVA包被抗原；采用直接競爭的方式，游離SAL和固相SAL-OVA包被抗原共同競爭有限的釤標SAL單抗，初步建立SAL時間分辨免疫分析方法。研究發現，優化的TRFIA半抑制量IC50為1.6 ng/mL，檢測范圍為0.39～12.77 ng/mL，最低檢測限為0.136 ng/mL。對其他常用β-興奮劑進行交叉反應分析發現，建立的TRFIA方法特異選擇性高，與克倫特羅的交叉率較小（2.29%），而與萊克多巴胺沒有交叉。將建立的 TRFIA 方法與基于同源單克隆抗體而建立的酶聯免疫分析法（ELISA）、熒光偏振免疫分析（FPIA）進行比較分析，結果表明，TRFIA方法的靈敏度、檢測性能與ELISA和FPIA方法相比有不同程度的提高。

參考文獻：

[1]謝敏浩，羅世能. 時間分辨熒光免疫分析螯合劑BCPDA合成[J]. 化學試劑，1994，16（6）：359-360.

[2]Faeste C K，Holden L. Sensitive time-resolved fluoroimmunoassay for the detection of hazelnut protein tSALes in food matrices[J]. Journal of Immunological Methods，2006，314：114-122.

[3]潘利華，周誓紅，孫文偉，等. 固相時間分辨熒光免疫標記技術研究[J]. 光譜學與光譜分析，2004，24（12）：1601-1604.

[4]王蕾，吳英松，湯永平，等. 應用時間分辨熒光免疫分析技術檢測SARS病毒抗原的初步研究[J]. 第一軍醫大學學報，2005，25（4）：429-431，434.

[5]黃飚，陶文沂，張蓮芬，等. 赭曲霉毒素A的高靈敏時間分辨熒光免疫分析[J]. 生物化學與生物物理進展，2005，32（7）：662-666.

[6]黃飚，陶文沂，張蓮芬，等. 黃曲霉毒素B1的高靈敏時間分辨熒光免疫分析[J]. 核技術，2006，29（4）：295-300.

[7]Shen J Z，Zhen Z Y Y. Time-resolved fluoroimmunoassay for SAL to pamine in swin tissue[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2007，387：1561-1564.

[8]王永成，唐棣，常文保，等. 時間分辨熒光免疫分析法間接測定雌二醇[J]. 分析科學學報，2001，17（2）：89-92.[HJ][FL）]