川芎內生放線菌活性菌的篩選及鑒定

林嬋春++何冬梅++李佳穗++柳敏++嚴鑄云

摘要：為了了解川芎內生放線菌抑制常見致病菌的能力，從中篩選活性較強的放線菌資源，采用紙片擴散法測定發酵提取液對5種指示菌的抑菌活性，結合經典分類法和分子生物學法鑒定活性菌種。結果表明，對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、黑曲霉（Aspergillus niger）和白色念球菌（Canidia albicans）表現抑制活性的菌株占川芎內生放線菌的百分比分別為83.33%、76.67%、23.33%、3000%、13.33%；從中選出4株活性較強的放線菌，Blast比對結果表明，菌株F3、F19、F-L-5、F-L-7的16S rDNA序列與GenBank已知序列鏈霉菌屬金色類群[Streptomyces sp.（KF126314.1）]、暗灰鏈霉菌[Streptomyces canus（AB7184118.1）]、腫痂鏈霉菌[Streptomyces turgidiscabies（FJ883749.1）]、暗色產色鏈霉菌[Streptomyces phaeochromogenes（KP718589.1）]高度相似，同源性分別為99%、100%、99%、99%。綜合鑒定，F3為鏈霉菌屬金色類群，F19為暗灰鏈霉菌，F-L-5為腫痂鏈霉菌，F-L-7為暗色產色鏈霉菌。表明川芎內生放線菌中具有應用潛力的高活性菌株，并鑒定出4株活性菌。

關鍵詞：川芎；內生放線菌；抑菌活性；菌種鑒定；鏈霉菌

中圖分類號： S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）03-0076-04

收稿日期：2016-07-17[HJ1.4mm]

基金項目：國家自然科學基金（編號：81001610）；高等學校博士學科點專項科研基金（編號：20135132110004）；成都中醫藥大學科技發展基金（編號：ZRQN1546）。

作者簡介：林嬋春（1989—），女，碩士研究生，主要從事藥用植物微生態研究。E-mail：1297107706@qq.com。

通信作者：嚴鑄云，教授，博士生導師，主要從事道地藥材品質形成與調控研究。Tel：（028）61800231；E-mail：cdutcmyan@126.com。[HJ]

放線菌是尋找和發現天然活性物質的生物資源之一，也是人們不懈研究的熱點[1]。目前，發現新放線菌及新活性物質變得越來越困難，人們開始從特殊生境中尋找有用的放線菌[2]。植物內生放線菌生長環境獨特，常產生多種類型的代謝產物[3]。筆者所在課題組前期篩選出了對川芎根腐病病原菌有拮抗活性的川芎內生放線菌[4]。本研究選取代表性細菌及真菌作為指示菌，篩選具有抑菌作用的放線菌資源，為開發利用植物內生放線菌提供技術支撐。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種川芎內生放線菌由課題組從健康川芎根莖中進一步分離并保存。

1.1.2指示菌[5-6]革蘭氏陰性菌：大腸桿菌（Escherichia coli）；革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；酵母狀真菌：白色念球菌（Canidia albicans）；絲狀真菌：黑曲霉（Aspergillus niger）。以上菌株均由成都中醫藥大學醫學技術學院贈予。

1.1.3培養基發酵培養基采用高氏1號液體培養基。形態特征、培養特征及生理生化測定所用培養基的成分和制備方法均參考《鏈霉菌鑒定手冊》[6]和《放線菌系統學》[7]。活化培養細菌、黑曲霉及白色念球菌的培養基分別采用肉湯培養基、馬鈴薯葡萄糖培養基、沙氏培養基，成分和制備方法參照文獻[8-9]。

1.2方法

1.2.1[JP2]發酵粗提液的制備將供試菌株在高氏1號培養基上活化培養5 d，接種1枚直徑5 mm的菌餅于250 mL發酵瓶中，每瓶發酵液50 mL。28 ℃、2 000 r/min搖瓶培養，6 d后取出發酵液4 000 r/min離心15 min，取上清液，等體積乙酸乙酯萃取2次，35 ℃旋轉蒸發獲得漿狀物2～3 mL，35 ℃下揮發干，最后用無水乙醇定容至1 mL，過0.22 μm濾膜，保存備用[10]。[JP]

1.2.2抑菌活性測定采用紙片法[10]測定內生放線菌發酵液的抑菌活性，即將60 μL發酵粗提液分次加到9 mm無菌濾紙片上，待乙醇揮發干后接于含指示菌的平板上。細菌用5 mg/mL 的雙抗溶液10 μL為對照（CK1），真菌用5 mg/mL氟康唑溶液20 μL為對照（CK2），設3組重復，24～48 h后測量抑菌圈的直徑，以平均抑菌圈直徑大小作為抑菌活性強弱的判斷標準。

1.2.3形態及生理生化特征菌株的形態特征采用插片法在光學顯微鏡下觀察。培養特征及生理生化特性采用常規放線菌鑒定方法，并參照文獻[11]及《鏈霉菌鑒定手冊》[6]中推薦的培養基。

1.2.4分子水平鑒定采用高氏1號液體富集培養方式，獲取菌絲，用液氮充分研磨破壁后，結合試劑盒TIANamp Bacteria DNA Kit（TIANGEN）提取基因組DNA[12]。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗DNA提取效果。采用放線菌通用引物27F和1 492R對放線菌的16S rDNA 進行PCR擴增。反應體系為25 μL：DNA模板2 μL，10 pmol/μL上、下游引物各1 μL，2×Taq Master Mix[天根生化科技（北京）有限公司]12 μL，ddH2O[天根生化科技（北京）有限公司]10 μL，參照文獻[12]中的程序擴增。PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，再送成都擎科梓熙生物技術有限公司測序。將測定的序列進行Blast比對，并從GenBank數據庫中下載同源性極高的序列，采用MEGA5.1軟件構建系統進化樹。

2結果與分析

2.1川芎內生放線菌的活性菌株

通過紙片法考察了30株川芎內生放線菌的抑菌活性（表1）。結果表明，不同內生放線菌對5種致病菌分別表現出不同的抑制活性。有83.33%的內生放線菌對金黃色葡萄球菌表現抑制活性，有76.67%的內生放線菌對枯草芽孢桿菌表現抑制活性，而對大腸桿菌、黑曲霉和白色念球菌表現抑制活性的內生放線菌比例較低，分別為23.33%、30.00%、1667%。其中有3株放線菌對5種指示菌有抑制作用，有1株放線菌對4種指示菌有抑制作用。

對照組（CK1）對3種細菌的平均抑菌直徑均在13～14 mm 范圍內，抑菌圈內清晰。F3、F19、F-L-5和F-L-7對金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的抑制作用明顯，前3株菌的平均抑菌直徑大于13 mm，活性與CK1相仿。這4株菌均對大腸桿菌表現出抑制活性。對照組（CK2）對黑曲霉和白色念球菌的抑菌作用不明顯，平均抑菌直徑小于10.9 mm，且抑菌圈邊緣模糊。F19和F-L-7對黑曲霉表現出抑制活性，平均抑菌直徑為11.0～11.9 mm。F19和F-L-5對白色念球菌的平均抑菌直徑在12 mm以上，抑菌圈較CK2清晰。F3和F-L-7對白色念球菌及F3和F-L-5對黑曲霉無抑菌作用。擬將此4株菌作為具有應用潛力的高活性菌株，并進行菌種鑒定。

2.2川芎內生放線菌活性菌株的形態特征

將4株具有抑菌活性的菌株進行插片培養后，鏡檢菌絲、孢子鏈、孢子形態（圖1）。F3孢子絲直、斷裂、孢子單個或成對；F19孢子絲多圈松螺旋形，孢子卵圓形或球形；F-L-5 孢子鏈呈直或柔曲狀，孢子橢圓或球形；F-L-7孢子絲直或柔曲，孢子球形或長橢圓。在不同培養基上各菌株表現出不同的形態特征，詳細結果見表2。

2.3川芎內生放線菌活性菌株的生理生化特征

測試4株活性菌對9種碳源——阿拉伯糖（L-arabinose）、棉籽糖（raffinose）、甘露醇（D-mannit01）、木糖（D-xylose）、果糖（D-fructose）、鼠李糖（rhanmose）、葡萄糖（D-glucose）、[JP2]蔗糖（sucrose）、肌醇（meso-inositol）的利用情況，結果見表3。考察了4株活性菌的明膠液化、牛奶凝固與胨化、淀粉水解、纖維素上生長及H2S生成等一系列生理生化指標（表4）。可以看出F3能使牛奶胨化，呈淡黃色，能液化明膠，不能水解淀粉與纖維素，不產生H2S。

F19不能使牛奶凝固、胨化，能液化明膠，能水解淀粉，不能水解纖維素，不產生H2S。F-L-5 產酸使牛奶凝固、變紅、后胨化，能水解淀粉，不能水解纖維素，不產H2S。F-L-7能使牛奶凝固，變淡黃色，能水解淀粉，不能在纖維素上生長，能產H2S，使培養基呈類黑色。

2.416S rDNA序列測定及系統進化樹分析

采用試劑盒法提取活性放線菌 F3、F19、F-L-5及F-L-7 的基因組DNA，利用16S rDNA 通用引物27F和1492R進行PCR擴增，獲得長度為1 300～1 500 bp的清晰[JP3]條帶（圖2）。經測序獲得長度分別為1 373、1 364、1 308、1 379 bp[JP]的序列，GenBank登錄號分別為KU975441、KU975442、KU975443、KU975444。將所測序列與GenBank中已知序列進行Blast比對，F3與鏈霉菌屬金色類群[Streptomyces sp. （KP126314.1）]及[Streptomycesroseogriseus（2DQ02665.1）]相似度為99%，F19與暗灰鏈霉菌[Streptomyces canus（AB7184118.1）]相似度為100%，F-L-5與腫痂鏈霉菌[Streptomyces turgidiscabies（FJ883749.1）]相似度為99%，F-L-7與暗色產色鏈霉菌[Streptomyces phaeochromogenes（KP718589.1）]相似度為99%。用MEGA5.1軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構建系統發育樹（圖3）。由圖3可知，F3在系統進化樹上與鏈霉菌屬相近，這與形態特征相符，但與高相似度的種存在一定的差異，而且單獨聚為1 支，故暫定為鏈霉菌屬金色類群，其具體分類地位有待進一步確定。F19與暗灰鏈霉菌在自舉值99%水平聚為1支；F-L-5與腫痂鏈霉菌在自舉值98%水平聚為1支，F-L-7與暗色產色鏈霉菌在自舉值98%水平聚為1支。結合菌株的形態及生理生化特征，確定F19為暗灰鏈霉菌，F-L-5為腫痂鏈霉菌，F-L-7 為暗色產色鏈霉菌。

3結論與討論

[JP2]川芎內生放線菌的抑菌活性考察結果表明，主要抑制對象為革蘭氏陽性菌，而抑制革蘭氏陰性菌及真菌的作用較弱。從中選出了4株具有應用潛力的高活性菌株，菌種鑒定結果：鏈霉菌F3初步[JP]鑒定為鏈霉菌屬的金色類群；確定F19為暗灰[JP]鏈霉菌，F-L-5為腫痂鏈霉菌，F-L-7為暗色產色鏈霉菌。

暗色產色鏈霉菌和暗灰鏈霉菌均能產生多種抗生素及酶[13-16]，使暗色產色鏈霉菌和暗灰鏈霉菌具有重要的研發價值。腫痂鏈霉菌被報道為馬鈴薯瘡痂病的致病菌之一[17]，而滕青杉報道其能產生肉桂酰胺[18]。川芎內生菌腫痂鏈霉菌具有抑菌活性，其是否對川芎致病及能否產生肉桂酰胺類物質有待后續研究。

目前，尚未見有關川芎內生放線菌的研究，僅筆者所在課題組將分離自川芎的內生放線菌作為川芎根腐病生防菌的擬開發對象[4]。本試驗首次開展川芎內生放線菌的抑菌活性研究，可以為開發新的抗生素提供放線菌資源。然而其最優發酵條件、抑菌機制及活性成分等均有待進一步研究，期望在抗菌化合物方面開發具有應用前景的產品。

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