紅灰鏈霉菌HDZ—9—47防治小麥全蝕病的效果

金娜++盧修亮++劉倩++簡恒+??

摘要：通過室內(nèi)及盆栽試驗測定紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發(fā)酵液對小麥全蝕病的防治效果。室內(nèi)試驗結(jié)果表明，紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發(fā)酵濾液可抑制小麥全蝕病的菌絲生長，稀釋5、10、20、50、70、100、150、200倍的發(fā)酵濾液對菌絲生長抑制率分別為100%、95%、88%、77%、51%、40%、38%、28%。紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發(fā)酵液浸種3 h對小麥發(fā)芽率無影響。盆栽試驗結(jié)果表明，發(fā)酵液2次灌根處理可防治小麥全蝕病，在2012—2013年2次盆栽試驗中的防效分別為55%和41%。說明紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發(fā)酵液對小麥全蝕病有較好的防治效果，具有開發(fā)為生防制劑的潛力。

關(guān)鍵詞：紅灰鏈霉菌；小麥全蝕病；生物防治；防治效果

中圖分類號： S435.121.4+9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）03-0083-04

[HJ1.4mm]

收稿日期：2016-01-11

基金項目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（編號：201503114）。

作者簡介：金娜（1985—），女，黑龍江哈爾濱人，博士研究生，主要從事南方根結(jié)線蟲生防菌研究。E-mail：heidakingner@126.com。

通信作者：簡恒，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物病原線蟲研究。Tel：（010）62731102；E-mail：hengjian@cau.edu.cn。[HJ]

小麥全蝕病是由禾頂囊殼小麥變種（Gaeumannomyces graminis var. tritici）侵染引起的一種毀滅性病害，在世界范圍內(nèi)廣泛分布[1]。我國20世紀(jì)30年代首次在浙江省發(fā)現(xiàn)該病，近年來該病的發(fā)病面積和危害日益加重，已蔓延至華東、華北、西北地區(qū)的19個省，其中河南、山東和安徽等省份發(fā)生尤為嚴(yán)重。全蝕病從小麥苗期開始危害，造成苗期葉片發(fā)黃，麥苗生長緩慢，在成熟期引起植株大片枯死，造成小麥減產(chǎn)20%～50%，甚至絕收[2-3]。目前，抗小麥全蝕病的品種較少，輪作倒茬在小麥大面積種植區(qū)的應(yīng)用存在局限性，化學(xué)防治易造成抗藥性且污染環(huán)境[4]。因此，篩選有效防治小麥全蝕病的生防制劑勢在必行。

自從1934年美國和英國發(fā)現(xiàn)小麥全蝕病的抑制性土壤以來，生物防治便成為防治該病的一項重要措施[5]。研究發(fā)現(xiàn)，小麥根際的熒光假單胞桿菌（Pseudomonas fluorescens）通過產(chǎn)生抗生素（2，4-diacetylphloroglucinol，2，4-DAPG）在小麥全蝕病自然衰退土壤中發(fā)揮著主要作用[6]。目前國內(nèi)外都在開發(fā)利用熒光假單胞桿菌來防治小麥全蝕病，Yang等從河南省和江蘇省的小麥根際土壤中分離得到105株對小麥全蝕病具有抑制效果的假單胞菌[7]。除了熒光假單胞菌外，研究人員還發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌（Bacillus）、木霉菌（Trichoderma）、青霉菌（Penicillium）和芽枝霉（Cladosporium）等對小麥全蝕病有抑制作用[8]，但這些生防菌易受環(huán)境影響，防效不穩(wěn)定，大規(guī)模應(yīng)用很少，因此目前亟需篩選受環(huán)境因素影響小的生防因子[9]。放線菌中的鏈霉菌因其可以產(chǎn)生大量生命力強(qiáng)的孢子來抵御外界環(huán)境影響，而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)病害防治。目前放線菌的活體制劑Mycostop（Streptomyces griseovirdis K61）和Actinovate Soluble（Streptomyces lydicusstrain WYEC 108）等已被登記注冊為生物農(nóng)藥，用于防治鐮刀菌屬（Fusarium）、腐霉菌屬（Pythium）、疫霉菌屬（Phytophthora）等多種常見土傳病害[10]，但應(yīng)用鏈霉菌防治小麥全蝕病卻鮮有研究報道。本研究評價了紅灰鏈霉菌（S. rubrogriseus）HDZ-9-47對小麥全蝕病的防治效果，以期為小麥全蝕病的生物防治提供新方法。

1材料與方法

1.1供試菌株

紅灰鏈霉菌菌株HDZ-9-47，是從根結(jié)線蟲卵上分離得到的，由中國科學(xué)院微生物研究所真菌系統(tǒng)學(xué)及生物學(xué)研究室提供，保存于中國普通微生物菌種保藏中心（保藏編號為CGMCC 2878）。

1.2小麥全蝕病菌

小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis var. tritici）由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)張立群教授提供。

1.3供試培養(yǎng)基

高氏1號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g/L、NaClO 5 g/L、KNO3 1 g/L、K2HPO4·3H2O 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L、瓊脂20 g/L、pH值為7.3[11]。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉16.5 g/L、豆餅粉10 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、NH4NO3 1 g/L、CaCO3 1 g/L、K2HPO4·3H2O 1 g/L、MnSO4 0.338 g/L、pH值為7.3[12]。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL[11]。

玉米粉砂培養(yǎng)基：按玉米粉 ∶[KG-*3]沙 ∶[KG-*3]水為1 ∶[KG-*3]1 ∶[KG-*3]0.5的比例混合均勻，蒸煮1 h，冷卻后切成小塊，再裝入三角瓶中，每瓶約裝容量的1/3，121 ℃滅菌90 min，滅菌后趁熱搖勻，以免冷卻后結(jié)塊[13]。

1.4供試小麥品種

豫麥49號，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)李洪連教授提供。

1.5HDZ-9-47發(fā)酵液及發(fā)酵濾液的制備

孢子懸浮液的制備：將保存在菌種管中的紅灰鏈霉菌HDZ-9-47在高氏1號培養(yǎng)基平板上活化培養(yǎng)7 d后，在無菌超凈臺中，用無菌刀刮下培養(yǎng)板上的菌絲和孢子，懸浮于裝有4 mL無菌水的50 mL離心管中，在振蕩器上充分振蕩，制成孢子懸浮液。用血球計數(shù)板在顯微鏡下計算孢子數(shù)，調(diào)整終濃度為0.1億個孢子/mL[12]。

發(fā)酵液的制備：在無菌超凈臺中，用1 mL移液槍（Eppendrof，美國）吸取1 mL新制備的HDZ-9-47孢子懸浮液接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃，160 r/min 培養(yǎng)72 h[12]。

發(fā)酵濾液的制備：將發(fā)酵液置于離心管中，12 000 r/min 離心20 min，取上清液，用0.22 μL細(xì)菌過濾器過濾除去菌體。

1.6菌絲生長抑制率

采用菌絲生長速率法測定紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發(fā)酵濾液對小麥全蝕病菌的抑菌活性[14]。用融化的PDA培養(yǎng)基（55 ℃左右）將發(fā)酵濾液按體積比分別稀釋5、10、20、50、70、100、150、200倍，倒入直徑9.0 cm的滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，制成平板，以加無菌水的PDA平板為對照，再將直徑為5 mm的小麥全蝕病菌菌餅置于平板中央，于28 ℃下培養(yǎng)7 d，用十字交叉法測量小麥全蝕病菌菌落生長直徑，重復(fù)3次，根據(jù)公式（1）、（2）計算菌絲生長抑制率。

[JZ（]菌落直徑=測量直徑-菌餅直徑；[JZ）][JY]（1）

[HS2][HT9.，8.5]菌絲生長抑制率=[SX（]對照菌落直徑-處理菌落直徑對照菌落直徑[SX）]×100%。[JY]（2）[HT〗

1.7HDZ-9-47對小麥發(fā)芽率的影響

挑選大小一致，飽滿的小麥種子，用5% NaClO消毒 10 min，用無菌水沖洗3次后分別置于500 mL燒杯中。在燒杯中分別用發(fā)酵原液、10倍稀釋液、50倍稀釋液浸種3 h。將小麥種子腹溝向下整齊排列在鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿40粒。以清水為對照，置于自然條件下培養(yǎng)萌發(fā)。分別在1、2、3、4、7 d計算種子發(fā)芽數(shù)，以胚根突破種皮為準(zhǔn)[15]。根據(jù)公式（3）計算小麥種子發(fā)芽率。

[HS2][JZ（]發(fā)芽率=[SX（]發(fā)芽率種子總數(shù)[SX）]×100%。[JZ）][JY]（3）

1.8小麥全蝕病菌的擴(kuò)繁

在無菌條件下，將PDA平板邊緣生活力較強(qiáng)的菌餅（直徑0.8 cm）移入裝有玉米粉、沙的培養(yǎng)基的三角瓶中，每瓶5塊菌餅。然后置于25 ℃下恒溫培養(yǎng)，待菌絲長滿時，平行搖動1次，使菌絲體均勻生長，半個月后取出陰晾，備用[16]。

1.9HDZ-9-47對小麥全蝕病的防治效果

2012—2013年在盆栽試驗中評價施用紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發(fā)酵液對小麥全蝕病的防治效果。將擴(kuò)繁的小麥全蝕病菌與滅菌土按1 ∶[KG-*3]100的比例混勻，然后裝入20 cm的塑料盆中[16]。在播種前分別進(jìn)行以下處理：（1）麥種經(jīng)發(fā)酵液浸種3 h后播入缽中，以帶菌土蓋之（浸種）；（2）麥種經(jīng)發(fā)酵液浸種3 h后播入缽中，以帶菌土蓋之，小麥進(jìn)入返青期后，再用200 mL發(fā)酵液灌根（浸種+灌根）；（3）小麥播種后，用200 mL發(fā)酵液灌根（灌根）；（4）小麥播種后，用 200 mL 發(fā)酵液灌根，返青期后，再用200 mL發(fā)酵原液灌根（灌根+灌根）；（5）2%戊唑醇濕拌劑1 ∶[KG-*3]500拌種；（6）空白對照。每處理5盆，每盆20粒。分別在小麥灌漿期和收獲期按照以下分級方法和公式（4）、（5）調(diào)查發(fā)病情況和計算防效。

分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，無病；1級，變黑根面積占根總面積的5%以下；2級，變黑根面積占根總面積的6%～10%；3級，變黑根面積占根總面積的11%～25%；4級，變黑根面積占根總面積的26%～40%；5級，變黑根面積占根總面積的41%～65%；6級，變黑根面積占根總面積的66%～100%[17]。

[HS2][JZ（]病情指數(shù)=∑[JB（（][SX（]病級株數(shù)×該級代表數(shù)值調(diào)查總株數(shù)×發(fā)病最高一級的代表數(shù)[SX）][JB））]×100；[JZ）]

[JY]（4）[HT〗

[HS2][JZ（]防效=[SX（]對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)對照病情指數(shù)[SX）]×100%。[JZ）][JY]（5）

1.10數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與作圖，利用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析，并采用Tukey多重比較法（P<0.05）進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2結(jié)果與分析

2.1HDZ-9-47對小麥全蝕病菌的菌絲生長抑制率

由圖1可知，發(fā)酵濾液稀釋5、10、20、50、70、100、150、200倍均能抑制小麥全蝕病菌菌絲的生長，菌絲生長抑制率分別為100%、95%、88%、77%、51%、40%、38%、28%。結(jié)果表明[CM（25]，紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發(fā)酵濾液對小麥全蝕病菌有較[CM）]

[FK（W10][TPJN1.tif][FK）]

強(qiáng)的抑制作用，具有在盆栽試驗中防治小麥全蝕病的潛力。

2.2HDZ-9-47發(fā)酵液對小麥發(fā)芽率的影響

為考察在盆栽或田間應(yīng)用時，是否可以用HDZ-9-47發(fā)酵液對小麥種子進(jìn)行浸種處理以防治小麥全蝕病，本研究采用浸種法研究紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發(fā)酵液對小麥出芽率的影響。將小麥種子分別在紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發(fā)酵原液、10倍、50倍稀釋液及無菌水中浸種3 h，結(jié)果如圖2所示，浸泡在稀釋10倍發(fā)酵液中的小麥種子，在1、2 d發(fā)芽率低于對照水處理（P<0.05），但是3、4、7 d的發(fā)芽率與對照無顯著差異。發(fā)酵原液和稀釋50倍的發(fā)酵液在1、2、3、4、7 d均對小麥發(fā)芽率無顯著性影響。浸種后7 d，所有處理中的小麥發(fā)芽率都在80%以上。結(jié)果表明，發(fā)酵液浸種對小麥發(fā)芽率無影響，在田間可以應(yīng)用發(fā)酵液浸種法處理小麥種子。該研究結(jié)果為應(yīng)用紅灰鏈霉HDZ-9-47發(fā)酵液在田間防治小麥全蝕病奠定了基礎(chǔ)。

2.3HDZ-9-47對小麥全蝕病的防治效果

2012年盆栽試驗中用紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發(fā)酵液按4種不同的施用方法處理小麥。在灌漿期取樣調(diào)查結(jié)果（圖3）顯示，除了單獨(dú)用紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發(fā)酵液浸種處理外，發(fā)酵液其他處理均能顯著降低小麥全蝕病的發(fā)病級數(shù)（P<0.05）。對照的發(fā)病級數(shù)為1.89，而發(fā)酵液2次灌根、浸種后再灌根、單獨(dú)灌根處理的發(fā)病級數(shù)僅為0.59、059、0.88，防效分別為69%、69%、54%，其中浸種后灌根和2次灌根的防效顯著高于單獨(dú)灌根處理（P<0.05）。化學(xué)農(nóng)藥戊唑醇的發(fā)病級數(shù)為0.1，防效達(dá)95%。在收獲期調(diào)查取樣結(jié)果顯示，所有處理均能顯著降低小麥全蝕病的發(fā)病級數(shù)（P<0.05）。發(fā)酵液2次灌根的發(fā)病級數(shù)為0.83，防效為55%，浸種后灌根處理的發(fā)病級數(shù)為1.0，防效達(dá)46%，化學(xué)農(nóng)藥戊唑醇的防效達(dá)74%。由此可見，紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發(fā)酵液2次灌根可在一定程度上防治小麥全蝕病。[FL）]

[FK（W12][TPJN3.tif][FK）]

2013年盆栽試驗結(jié)果（圖4）顯示，在灌漿期所有處理都能顯著降低小麥全蝕病的發(fā)病級數(shù)（P<0.05）。對照的發(fā)病級數(shù)為5.6，化學(xué)農(nóng)藥戊唑醇處理的發(fā)病級數(shù)最低，為 2.6。浸種后再灌根、2次灌根處理中的發(fā)病級數(shù)分別為 3.3、3.4，顯著低于單獨(dú)浸種或1次灌根的4.5和4.2（P<0.05）。防效為化學(xué)農(nóng)藥戊唑醇54%>浸種后灌根41%>2次灌根39%>灌根25%>浸種19%（P<0.05）。在收獲期，對照的發(fā)病級數(shù)為5.9，所有處理都能顯著降低小麥全蝕病的發(fā)病級數(shù)（P<0.05）。化學(xué)農(nóng)藥戊唑醇、2次灌根處理的發(fā)病級數(shù)均為3.5，顯著低于單獨(dú)灌根、浸種后灌根、單獨(dú)浸種的45、4.9、4.8（P<0.05）。各處理的防效為戊唑醇41%=2次灌根41%>灌根25%>浸種19%>浸種后灌根17%。由此可見，紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發(fā)酵液2次灌根處理防治小麥全蝕病的效果與化學(xué)農(nóng)藥戊唑醇相當(dāng)。

2012—2013年2次盆栽試驗結(jié)果均表明，用紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發(fā)酵液分別在小麥播種期和返青期灌根可防治小麥全蝕病的發(fā)生，紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發(fā)酵液具有用于田間防治小麥全蝕病的潛力。

3結(jié)論與討論

小麥?zhǔn)俏覈闹饕Z食作物，近年來種植面積達(dá)2 400萬hm2左右，病蟲害是影響其穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的主要原因。據(jù)統(tǒng)計，我國小麥上常見病蟲害有70多種，每年因病蟲害損失小麥25億～30億kg，發(fā)生普遍、危害嚴(yán)重的病害主要有小麥條銹病、紋枯病、全蝕病、根腐病、孢囊線蟲病等，這些病害常常發(fā)生復(fù)合侵染，從而造成作物更嚴(yán)重的產(chǎn)量損失[18-19]。據(jù)Smiley等報道，作物被植物寄生線蟲侵染后更容易被其他土傳真菌病害侵染， 例如落選短體線蟲（Pratylenchus neglectus）[FL）]

[TPJN4.tif][FK）]

單獨(dú)侵染小麥時，小麥產(chǎn)量損失8%～36%，但是當(dāng)落選短體線蟲、小麥孢囊線蟲（Heterodera avenae）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani AG-8）、小麥全蝕病菌共同侵染小麥時，小麥產(chǎn)量損失高達(dá)71%[19]。因此，篩選出具有廣譜活性的生防菌對我國小麥生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

鏈霉菌用于防治植物病害已有較多報道，但是用于防治小麥全蝕病卻鮮有報道[20]。紅灰鏈霉菌HDZ-9-47是從根結(jié)線蟲卵上分離得到的，前期的室內(nèi)試驗結(jié)果表明，紅灰鏈霉菌HDZ-9-47對小麥孢囊線蟲2齡幼蟲的致死率達(dá)44%。本研究在室內(nèi)及盆栽試驗中評價了紅灰鏈霉菌 HDZ-9-47對小麥全蝕病的防治效果，結(jié)果顯示在室內(nèi)紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發(fā)酵濾液對小麥全蝕病菌具有較強(qiáng)的抑菌活性。在2012—2013年的盆栽試驗中，發(fā)酵液2次灌根對小麥全蝕病菌的防效分別為55%和41%，其防效和化學(xué)農(nóng)藥戊唑醇的防效相當(dāng)，說明紅灰鏈霉菌HDZ-9-47具有開發(fā)為生防制劑在田間防治小麥全蝕病的潛力。2012年小麥全蝕病的發(fā)病級數(shù)較低，因此2012年各處理的防效均高于2013年，但無論是在小麥全蝕病發(fā)病嚴(yán)重的情況下還是在較輕的情況下，施用紅灰鏈霉菌 HDZ-9-47發(fā)酵液都可防治小麥全蝕病的發(fā)生。綜上所述，紅灰鏈霉菌HDZ-9-47對危害小麥的孢囊線蟲病和小麥全蝕病都有抑制效果，如果在田間施用紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發(fā)酵液可以同時防治這2種病害，那么對小麥的生產(chǎn)會有十分重要的應(yīng)用價值，因此下一步還將繼續(xù)研究紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發(fā)酵液對小麥孢囊線蟲和小麥全蝕病的田間防治效果，以期研究開發(fā)出同時防治2種病害的高效生防制劑。

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