紅灰鏈霉菌HDZ—9—47防治小麥全蝕病的效果

金娜++盧修亮++劉倩++簡恒+??

摘要：通過室內及盆栽試驗測定紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發酵液對小麥全蝕病的防治效果。室內試驗結果表明，紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發酵濾液可抑制小麥全蝕病的菌絲生長，稀釋5、10、20、50、70、100、150、200倍的發酵濾液對菌絲生長抑制率分別為100%、95%、88%、77%、51%、40%、38%、28%。紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發酵液浸種3 h對小麥發芽率無影響。盆栽試驗結果表明，發酵液2次灌根處理可防治小麥全蝕病，在2012—2013年2次盆栽試驗中的防效分別為55%和41%。說明紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發酵液對小麥全蝕病有較好的防治效果，具有開發為生防制劑的潛力。

關鍵詞：紅灰鏈霉菌；小麥全蝕病；生物防治；防治效果

中圖分類號： S435.121.4+9文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）03-0083-04

[HJ1.4mm]

收稿日期：2016-01-11

基金項目：公益性行業（農業）科研專項（編號：201503114）。

作者簡介：金娜（1985—），女，黑龍江哈爾濱人，博士研究生，主要從事南方根結線蟲生防菌研究。E-mail：heidakingner@126.com。

通信作者：簡恒，教授，博士生導師，主要從事植物病原線蟲研究。Tel：（010）62731102；E-mail：hengjian@cau.edu.cn。[HJ]

小麥全蝕病是由禾頂囊殼小麥變種（Gaeumannomyces graminis var. tritici）侵染引起的一種毀滅性病害，在世界范圍內廣泛分布[1]。我國20世紀30年代首次在浙江省發現該病，近年來該病的發病面積和危害日益加重，已蔓延至華東、華北、西北地區的19個省，其中河南、山東和安徽等省份發生尤為嚴重。全蝕病從小麥苗期開始危害，造成苗期葉片發黃，麥苗生長緩慢，在成熟期引起植株大片枯死，造成小麥減產20%～50%，甚至絕收[2-3]。目前，抗小麥全蝕病的品種較少，輪作倒茬在小麥大面積種植區的應用存在局限性，化學防治易造成抗藥性且污染環境[4]。因此，篩選有效防治小麥全蝕病的生防制劑勢在必行。

自從1934年美國和英國發現小麥全蝕病的抑制性土壤以來，生物防治便成為防治該病的一項重要措施[5]。研究發現，小麥根際的熒光假單胞桿菌（Pseudomonas fluorescens）通過產生抗生素（2，4-diacetylphloroglucinol，2，4-DAPG）在小麥全蝕病自然衰退土壤中發揮著主要作用[6]。目前國內外都在開發利用熒光假單胞桿菌來防治小麥全蝕病，Yang等從河南省和江蘇省的小麥根際土壤中分離得到105株對小麥全蝕病具有抑制效果的假單胞菌[7]。除了熒光假單胞菌外，研究人員還發現芽孢桿菌（Bacillus）、木霉菌（Trichoderma）、青霉菌（Penicillium）和芽枝霉（Cladosporium）等對小麥全蝕病有抑制作用[8]，但這些生防菌易受環境影響，防效不穩定，大規模應用很少，因此目前亟需篩選受環境因素影響小的生防因子[9]。放線菌中的鏈霉菌因其可以產生大量生命力強的孢子來抵御外界環境影響，而被廣泛應用于農業病害防治。目前放線菌的活體制劑Mycostop（Streptomyces griseovirdis K61）和Actinovate Soluble（Streptomyces lydicusstrain WYEC 108）等已被登記注冊為生物農藥，用于防治鐮刀菌屬（Fusarium）、腐霉菌屬（Pythium）、疫霉菌屬（Phytophthora）等多種常見土傳病害[10]，但應用鏈霉菌防治小麥全蝕病卻鮮有研究報道。本研究評價了紅灰鏈霉菌（S. rubrogriseus）HDZ-9-47對小麥全蝕病的防治效果，以期為小麥全蝕病的生物防治提供新方法。

1材料與方法

1.1供試菌株

紅灰鏈霉菌菌株HDZ-9-47，是從根結線蟲卵上分離得到的，由中國科學院微生物研究所真菌系統學及生物學研究室提供，保存于中國普通微生物菌種保藏中心（保藏編號為CGMCC 2878）。

1.2小麥全蝕病菌

小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis var. tritici）由中國農業大學張立群教授提供。

1.3供試培養基

高氏1號培養基：可溶性淀粉20 g/L、NaClO 5 g/L、KNO3 1 g/L、K2HPO4·3H2O 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L、瓊脂20 g/L、pH值為7.3[11]。

發酵培養基：玉米粉16.5 g/L、豆餅粉10 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、NH4NO3 1 g/L、CaCO3 1 g/L、K2HPO4·3H2O 1 g/L、MnSO4 0.338 g/L、pH值為7.3[12]。

PDA培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL[11]。

玉米粉砂培養基：按玉米粉 ∶[KG-*3]沙 ∶[KG-*3]水為1 ∶[KG-*3]1 ∶[KG-*3]0.5的比例混合均勻，蒸煮1 h，冷卻后切成小塊，再裝入三角瓶中，每瓶約裝容量的1/3，121 ℃滅菌90 min，滅菌后趁熱搖勻，以免冷卻后結塊[13]。

1.4供試小麥品種

豫麥49號，由河南農業大學李洪連教授提供。

1.5HDZ-9-47發酵液及發酵濾液的制備

孢子懸浮液的制備：將保存在菌種管中的紅灰鏈霉菌HDZ-9-47在高氏1號培養基平板上活化培養7 d后，在無菌超凈臺中，用無菌刀刮下培養板上的菌絲和孢子，懸浮于裝有4 mL無菌水的50 mL離心管中，在振蕩器上充分振蕩，制成孢子懸浮液。用血球計數板在顯微鏡下計算孢子數，調整終濃度為0.1億個孢子/mL[12]。

發酵液的制備：在無菌超凈臺中，用1 mL移液槍（Eppendrof，美國）吸取1 mL新制備的HDZ-9-47孢子懸浮液接入裝有100 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，28 ℃，160 r/min 培養72 h[12]。

發酵濾液的制備：將發酵液置于離心管中，12 000 r/min 離心20 min，取上清液，用0.22 μL細菌過濾器過濾除去菌體。

1.6菌絲生長抑制率

采用菌絲生長速率法測定紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發酵濾液對小麥全蝕病菌的抑菌活性[14]。用融化的PDA培養基（55 ℃左右）將發酵濾液按體積比分別稀釋5、10、20、50、70、100、150、200倍，倒入直徑9.0 cm的滅菌培養皿內，制成平板，以加無菌水的PDA平板為對照，再將直徑為5 mm的小麥全蝕病菌菌餅置于平板中央，于28 ℃下培養7 d，用十字交叉法測量小麥全蝕病菌菌落生長直徑，重復3次，根據公式（1）、（2）計算菌絲生長抑制率。

[JZ（]菌落直徑=測量直徑-菌餅直徑；[JZ）][JY]（1）

[HS2][HT9.，8.5]菌絲生長抑制率=[SX（]對照菌落直徑-處理菌落直徑對照菌落直徑[SX）]×100%。[JY]（2）[HT〗

1.7HDZ-9-47對小麥發芽率的影響

挑選大小一致，飽滿的小麥種子，用5% NaClO消毒 10 min，用無菌水沖洗3次后分別置于500 mL燒杯中。在燒杯中分別用發酵原液、10倍稀釋液、50倍稀釋液浸種3 h。將小麥種子腹溝向下整齊排列在鋪有濕濾紙的培養皿中，每皿40粒。以清水為對照，置于自然條件下培養萌發。分別在1、2、3、4、7 d計算種子發芽數，以胚根突破種皮為準[15]。根據公式（3）計算小麥種子發芽率。

[HS2][JZ（]發芽率=[SX（]發芽率種子總數[SX）]×100%。[JZ）][JY]（3）

1.8小麥全蝕病菌的擴繁

在無菌條件下，將PDA平板邊緣生活力較強的菌餅（直徑0.8 cm）移入裝有玉米粉、沙的培養基的三角瓶中，每瓶5塊菌餅。然后置于25 ℃下恒溫培養，待菌絲長滿時，平行搖動1次，使菌絲體均勻生長，半個月后取出陰晾，備用[16]。

1.9HDZ-9-47對小麥全蝕病的防治效果

2012—2013年在盆栽試驗中評價施用紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發酵液對小麥全蝕病的防治效果。將擴繁的小麥全蝕病菌與滅菌土按1 ∶[KG-*3]100的比例混勻，然后裝入20 cm的塑料盆中[16]。在播種前分別進行以下處理：（1）麥種經發酵液浸種3 h后播入缽中，以帶菌土蓋之（浸種）；（2）麥種經發酵液浸種3 h后播入缽中，以帶菌土蓋之，小麥進入返青期后，再用200 mL發酵液灌根（浸種+灌根）；（3）小麥播種后，用200 mL發酵液灌根（灌根）；（4）小麥播種后，用 200 mL 發酵液灌根，返青期后，再用200 mL發酵原液灌根（灌根+灌根）；（5）2%戊唑醇濕拌劑1 ∶[KG-*3]500拌種；（6）空白對照。每處理5盆，每盆20粒。分別在小麥灌漿期和收獲期按照以下分級方法和公式（4）、（5）調查發病情況和計算防效。

分級標準：0級，無病；1級，變黑根面積占根總面積的5%以下；2級，變黑根面積占根總面積的6%～10%；3級，變黑根面積占根總面積的11%～25%；4級，變黑根面積占根總面積的26%～40%；5級，變黑根面積占根總面積的41%～65%；6級，變黑根面積占根總面積的66%～100%[17]。

[HS2][JZ（]病情指數=∑[JB（（][SX（]病級株數×該級代表數值調查總株數×發病最高一級的代表數[SX）][JB））]×100；[JZ）]

[JY]（4）[HT〗

[HS2][JZ（]防效=[SX（]對照病情指數-處理病情指數對照病情指數[SX）]×100%。[JZ）][JY]（5）

1.10數據分析

試驗數據用Excel進行數據統計與作圖，利用SPSS 19.0統計軟件進行方差分析，并采用Tukey多重比較法（P<0.05）進行差異顯著性檢驗。

2結果與分析

2.1HDZ-9-47對小麥全蝕病菌的菌絲生長抑制率

由圖1可知，發酵濾液稀釋5、10、20、50、70、100、150、200倍均能抑制小麥全蝕病菌菌絲的生長，菌絲生長抑制率分別為100%、95%、88%、77%、51%、40%、38%、28%。結果表明[CM（25]，紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發酵濾液對小麥全蝕病菌有較[CM）]

[FK（W10][TPJN1.tif][FK）]

強的抑制作用，具有在盆栽試驗中防治小麥全蝕病的潛力。

2.2HDZ-9-47發酵液對小麥發芽率的影響

為考察在盆栽或田間應用時，是否可以用HDZ-9-47發酵液對小麥種子進行浸種處理以防治小麥全蝕病，本研究采用浸種法研究紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發酵液對小麥出芽率的影響。將小麥種子分別在紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發酵原液、10倍、50倍稀釋液及無菌水中浸種3 h，結果如圖2所示，浸泡在稀釋10倍發酵液中的小麥種子，在1、2 d發芽率低于對照水處理（P<0.05），但是3、4、7 d的發芽率與對照無顯著差異。發酵原液和稀釋50倍的發酵液在1、2、3、4、7 d均對小麥發芽率無顯著性影響。浸種后7 d，所有處理中的小麥發芽率都在80%以上。結果表明，發酵液浸種對小麥發芽率無影響，在田間可以應用發酵液浸種法處理小麥種子。該研究結果為應用紅灰鏈霉HDZ-9-47發酵液在田間防治小麥全蝕病奠定了基礎。

2.3HDZ-9-47對小麥全蝕病的防治效果

2012年盆栽試驗中用紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發酵液按4種不同的施用方法處理小麥。在灌漿期取樣調查結果（圖3）顯示，除了單獨用紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發酵液浸種處理外，發酵液其他處理均能顯著降低小麥全蝕病的發病級數（P<0.05）。對照的發病級數為1.89，而發酵液2次灌根、浸種后再灌根、單獨灌根處理的發病級數僅為0.59、059、0.88，防效分別為69%、69%、54%，其中浸種后灌根和2次灌根的防效顯著高于單獨灌根處理（P<0.05）。化學農藥戊唑醇的發病級數為0.1，防效達95%。在收獲期調查取樣結果顯示，所有處理均能顯著降低小麥全蝕病的發病級數（P<0.05）。發酵液2次灌根的發病級數為0.83，防效為55%，浸種后灌根處理的發病級數為1.0，防效達46%，化學農藥戊唑醇的防效達74%。由此可見，紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發酵液2次灌根可在一定程度上防治小麥全蝕病。[FL）]

[FK（W12][TPJN3.tif][FK）]

2013年盆栽試驗結果（圖4）顯示，在灌漿期所有處理都能顯著降低小麥全蝕病的發病級數（P<0.05）。對照的發病級數為5.6，化學農藥戊唑醇處理的發病級數最低，為 2.6。浸種后再灌根、2次灌根處理中的發病級數分別為 3.3、3.4，顯著低于單獨浸種或1次灌根的4.5和4.2（P<0.05）。防效為化學農藥戊唑醇54%>浸種后灌根41%>2次灌根39%>灌根25%>浸種19%（P<0.05）。在收獲期，對照的發病級數為5.9，所有處理都能顯著降低小麥全蝕病的發病級數（P<0.05）。化學農藥戊唑醇、2次灌根處理的發病級數均為3.5，顯著低于單獨灌根、浸種后灌根、單獨浸種的45、4.9、4.8（P<0.05）。各處理的防效為戊唑醇41%=2次灌根41%>灌根25%>浸種19%>浸種后灌根17%。由此可見，紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發酵液2次灌根處理防治小麥全蝕病的效果與化學農藥戊唑醇相當。

2012—2013年2次盆栽試驗結果均表明，用紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發酵液分別在小麥播種期和返青期灌根可防治小麥全蝕病的發生，紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發酵液具有用于田間防治小麥全蝕病的潛力。

3結論與討論

小麥是我國的主要糧食作物，近年來種植面積達2 400萬hm2左右，病蟲害是影響其穩產、高產的主要原因。據統計，我國小麥上常見病蟲害有70多種，每年因病蟲害損失小麥25億～30億kg，發生普遍、危害嚴重的病害主要有小麥條銹病、紋枯病、全蝕病、根腐病、孢囊線蟲病等，這些病害常常發生復合侵染，從而造成作物更嚴重的產量損失[18-19]。據Smiley等報道，作物被植物寄生線蟲侵染后更容易被其他土傳真菌病害侵染， 例如落選短體線蟲（Pratylenchus neglectus）[FL）]

[TPJN4.tif][FK）]

單獨侵染小麥時，小麥產量損失8%～36%，但是當落選短體線蟲、小麥孢囊線蟲（Heterodera avenae）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani AG-8）、小麥全蝕病菌共同侵染小麥時，小麥產量損失高達71%[19]。因此，篩選出具有廣譜活性的生防菌對我國小麥生產的可持續發展具有重要意義。

鏈霉菌用于防治植物病害已有較多報道，但是用于防治小麥全蝕病卻鮮有報道[20]。紅灰鏈霉菌HDZ-9-47是從根結線蟲卵上分離得到的，前期的室內試驗結果表明，紅灰鏈霉菌HDZ-9-47對小麥孢囊線蟲2齡幼蟲的致死率達44%。本研究在室內及盆栽試驗中評價了紅灰鏈霉菌 HDZ-9-47對小麥全蝕病的防治效果，結果顯示在室內紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發酵濾液對小麥全蝕病菌具有較強的抑菌活性。在2012—2013年的盆栽試驗中，發酵液2次灌根對小麥全蝕病菌的防效分別為55%和41%，其防效和化學農藥戊唑醇的防效相當，說明紅灰鏈霉菌HDZ-9-47具有開發為生防制劑在田間防治小麥全蝕病的潛力。2012年小麥全蝕病的發病級數較低，因此2012年各處理的防效均高于2013年，但無論是在小麥全蝕病發病嚴重的情況下還是在較輕的情況下，施用紅灰鏈霉菌 HDZ-9-47發酵液都可防治小麥全蝕病的發生。綜上所述，紅灰鏈霉菌HDZ-9-47對危害小麥的孢囊線蟲病和小麥全蝕病都有抑制效果，如果在田間施用紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發酵液可以同時防治這2種病害，那么對小麥的生產會有十分重要的應用價值，因此下一步還將繼續研究紅灰鏈霉菌HDZ-9-47發酵液對小麥孢囊線蟲和小麥全蝕病的田間防治效果，以期研究開發出同時防治2種病害的高效生防制劑。

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