羅非魚細菌性敗血癥病原菌嗜水氣單胞菌拮抗菌株的篩選和鑒定

李夢茜 +張振旺

摘要：嗜水氣單胞菌是動物和人類的致病菌，會引起水產動物敗血癥和人類腹瀉病等，對我國已造成了巨大的經濟損失。采用細菌的分離、純化和篩選等步驟，獲得對嗜水氣單胞菌引起羅非魚敗血癥有抑制作用的菌株LFJK-11，并對其形態特征和生理生化特性進行分析。結果顯示，該菌株屬于鏈霉菌屬。通過對其16S DNA比對及其系統進化樹構建，該菌株與鏈霉菌屬相似性達到100%，該結果與其形態特征和生理生化鑒定結果一致。

關鍵詞：羅非魚；嗜水氣單胞菌；敗血癥；鏈霉菌；篩選；鑒定；形態特征；生理生化特征

中圖分類號： S943.125.42+9文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）03-0129-02

收稿日期：2016-01-28

基金項目：生物化工廣西重點學科（河池學院）建設基金（201308）；廣西高校中青年教師基礎能力提升項目（編號：KY2016LX286）；河池學院校級重點科研課題（編號：XJ2016ZD001）；廣西壯族自治區級大學生創新創業訓練主項項目（編號：201610605079）。

作者簡介：李夢茜（1986—），女，河南周口人，碩士，講師，從事微生物藥物學。E-mail：limengxi66@126.com。

通信作者：張振旺，博士研究生，從事生物技術研究。E-mail：zhenwangzhang@126.com。

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）廣泛存在于含水量豐富的土壤、淡水、污水、沼澤和糞便中，一部分是動物和人類的致病菌，會引起水產動物敗血癥和人類腹瀉病等[1-2]。嗜水氣單胞菌一直嚴重危害著水產動物養殖業和人類健康，已造成了巨大的經濟損失[3]。據不完全統計，我國每年水產動物養殖業因疾病造成的經濟損失超過100億元[4]，可見水產養殖病害防治的任務十分艱巨。運用生物防治的手段篩選和應用嗜水氣單胞菌拮抗菌，應用于水產養殖，減少化學試劑的使用，以減少水產養殖業的經濟損失。

1材料與方法

1.1材料

指示菌為嗜水氣單胞菌HCLF-2，由筆者所在實驗室從患敗血癥的羅非魚中分離得到；以嗜水氣單胞菌HCLF-2為指示菌，從土壤分離篩選獲得拮抗菌株 LFJK-11。

1.2方法

1.2.1拮抗菌株的篩選

采用平板稀釋培養法[5]培養菌株，根據微生物菌落特征（大小、形狀、邊緣形狀、表面結構、光澤、透明度和顏色）將單菌落挑出并編號。將所獲得的土壤單菌落用PDA 培養基在28 ℃條件下培養4 d，采用抑菌圈法，以嗜水氣單胞菌HCLF-2為指示菌，篩選對嗜水氣單胞菌HCLF-2抑菌作用的菌株并保存。

1.2.2拮抗菌株的培養特征

選擇拮抗性能最佳的菌株，并將其接種于蔗糖察氏、燕麥、無機淀粉、馬鈴薯、葡萄糖酵母膏培養基中，在28 ℃下培養3～7d，觀察并記錄待測菌在不同培養基上的生長形態、基內菌絲、氣生菌絲及色素。

1.2.3生理生化特征的鑒定

測定纖維素水解、明膠液化、碳源利用、淀粉水解和H2S 產生等試驗[6]。

1.2.4菌株16S rDNA序列的測定及其系統發育樹的構建

將菌株LFJK-11接種在LB 培養基上振蕩培養12～18 h，參照文獻[7]的方法提取基因組DNA。以DNA 組為模板，以16S rDNA基因擴增通用引物進行PCR擴增，擴增出16S rDNA，[JP3]其中引物序列為：27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-[JP]3′；1492R。5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。用1% 瓊脂糖凝膠進行電泳分離，用DNA 膠回收試劑盒純化，然后直接寄至上海生工測序部進行測序。將測序結果在NCBI 上進行比對分析，篩選出9株菌株16S rDNA的全序列，使用ClustalW軟件構建系統進化樹。

2結果與分析

2.1拮抗菌株篩選結果

經拮抗檢測篩選到1 株對嗜水氣單胞菌HCLF-2有較強拮抗作用的菌株，編號為LFJK-11，抑菌圈直徑平均為156 mm（圖1）。如表1 所示，LFJK-11菌株對蘇云金桿菌、金黃色葡萄球菌、黑霉菌、大腸桿菌也有一定的拮抗作用，且該菌株對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌抑菌效果最強，對黑霉菌抑菌效果最弱；發酵液稀釋30～60 倍后對這幾種病原菌仍有拮抗作用，可見該菌株發酵性能良好。

2.2拮抗菌株培養特征觀察

用劃線法將菌株分別接種在蔗糖察氏、燕麥、無機淀粉、馬鈴薯、葡萄糖酵母膏培養基上，于28 ℃下培養7 d，結果如表2所示，葡萄糖酵母膏培養基上的菌株生長最好，生長速度較快，菌落較大，邊緣呈放線狀向外擴散，表面干燥有突起，孢子呈圓形，具有土腥味。馬鈴薯培養基菌株生長優良，向外擴散能力較強，且在培養3 d時菌落中出現金黃色疣，孢子呈鏈狀且菌落緊實不易挑取，培養7 d時顏色逐漸變深表面出現粉狀。

2.3菌絲特征

2.3.1MS培養基

應用插片法觀察菌絲特征，即分別在培養7、25 d后從MS培養基上取出插片，放在載玻片上滴加清水，放入40倍光鏡下觀察，結果如圖2所示，LFJK-11菌株菌絲較細，無隔膜，呈垂直直線狀，分枝較多，如樹枝般相互緊密交叉。待氣生菌絲成熟后，逐漸分化成圓形孢子。菌絲顏色由淺色至深黑色。

2.3.2種子培養基

洗下MS培養基上的LFJK-11菌株菌落[CM（25]，轉接到種子培養基中，于30[KG*3]℃、150[KG*3]r/min下培養3、7、[CM）]

[FK（W9][TPLMQ2.tif][FK）]

9 d，[JP2]再分別用結晶紫染色后在40倍光鏡下觀察，結果如表3所示，菌株菌絲細長，生長旺盛，呈放射狀向外生長并逐漸縮短增粗，致密交聯在一起，最終菌絲團松散、斷裂并向四周擴散。

2.4LFJK-11菌株生理生化特性

多種生理生化試驗結果如表4所示，LFJK-11菌株產淀粉水解酶、H2S，可以液化明膠，但不產纖維素酶，葡萄糖是比較理想的可利用的碳源。

2.5LFJK-11菌株16S rDNA序列測定及其系統發育樹的構建

LFJK-11菌株基因組測序所得16S rDNA 堿基序列，于 NCBI數據庫BLAST上進行比對，選取12株同源性高的菌株，構建系統進化樹，結果如圖3 所示，LFJK-11菌株以100% 的同源性屬于鏈霉菌屬。

3結論與討論

菌株的拮抗菌，經鑒定為鏈霉菌。通過抑菌試驗發現，LFJK-11菌株發酵液抑菌效果強，可以運用其發酵液來防治水產病原物。本試驗對LFJK-11菌株的生長特征、生理生化特征及其菌絲和基質特征進行研究，并對其進行16S rDNA測序比對并構建生物樹，最終確定該菌株為鏈霉菌屬菌株，所得結果與常規生理生化鑒定結果一致。

本試驗屬首次對LFJK-11菌株生長特征進行研究，且其發酵產物對于嗜水氣單胞菌HCLF-2菌株拮抗作用顯著，是一種較好的拮抗菌，對水產動物病原菌有較強的抑制活性，起抗病能力。此研究對于探尋水產動物及人類腸道病原物的生物防治以及水產業的發展有著十分重要的作用。

[HS2]參考文獻：

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[4]陳愛平. 2005年中國水產養殖病害監測報告（一）[J]. 科學養魚，2006（8）：48-49.

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趙萬樂，李艷玲，朱松波，等. 稀釋液中添加L-半胱氨酸對雞精液室溫保存的影響[J]. 江蘇農業科學，2017，45（3）：131-133.