稀釋液中添加L—半胱氨酸對(duì)雞精液室溫保存的影響

趙萬樂 李艷玲++朱松波 陳二平 +張兆旺

摘要：利用安卡紅種公雞新鮮精液，在A、B等2種稀釋液稀釋后分別添加不同濃度的L-半胱氨酸，測(cè)定精子活率和精子畸形率，比較不同濃度的半胱氨酸對(duì)雞精液在常溫保存下的效果。結(jié)果表明，在常溫下保存，在A稀釋液中添加1.0 mmol/L L-半胱氨酸的雞精液的各項(xiàng)指標(biāo)值均比不添加和添加5.0 mmol/L L-半胱氨酸的好（P<0.05），且保存效果較為理想。在B稀釋液中添加1.0、5.0 mmol/L L-半胱氨酸的精子有效存活時(shí)間極顯著高于對(duì)照組（P<001）；隨著L-半胱氨酸添加量的增多，生存指數(shù)值變大，且以添加5.0mmol/L L-半胱氨酸最高，但與添加 1.0 mmol/L L-半胱氨酸間差異不顯著（P>0.05）。但是，2種稀釋液中是否添加L-半胱氨酸對(duì)精子畸形率影響不大（P>0.05）。

關(guān)鍵詞：稀釋液；雞；精液；L-半胱氨酸；室溫保存；精子活率；畸形率

中圖分類號(hào)： S831.3+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）03-0131-03

收稿日期：2015-12-25

作者簡(jiǎn)介：趙萬樂（1987—），男，山西晉城人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事動(dòng)物繁殖技術(shù)方面的研究。E-mail：503587578@qq.com。

[JP2]精液保存會(huì)隨著時(shí)間的推移而使精子活力以及受精能力降低[1]，即使是使用一些比較好的稀釋液。精子在呼吸代謝過程中能產(chǎn)生活性氧族（ROS），攜帶有氧自由基，造成過氧化損傷，這是受精能力下降的重要原因之一。因此，在精液稀釋液中添加抵抗自由基的成分是很有必要的[2]。近些年，過氧化作用對(duì)精子的不良影響得到研究者的普遍重視，[JP]但是由于物種和抗氧化劑作用機(jī)理的不同，抗氧化劑在精液保存中的添加量和作用效果報(bào)道不盡相同。本試驗(yàn)根據(jù)雞精液的氧化原理和L-半胱氨酸的作用機(jī)理，在稀釋液中添加不同濃度的L-半胱氨酸，觀察精液在常溫下的保存效果，現(xiàn)報(bào)道如下。[JP]

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

選用15羽健康、繁殖性能好的安卡紅種公雞，供采精用。供試驗(yàn)雞的飼料配方見表1。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1稀釋液配方根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康呐渲?種基礎(chǔ)稀釋液A、B（表2）各250 mL，然后各取3份，均為30 mL，編號(hào)為A0、A1、A2，B0、B1、B2，以A0、B0為空白對(duì)照組，然后在控制A、B稀釋液滲透壓和pH值基本不變的基礎(chǔ)上分別向其中添加不同濃度的L-半胱氨酸，制成A1、A2、B1、B2等4種稀釋液，其中A1、B1中1.0 mmol/L L-半胱氨酸添加量為 3.6 mg，A2、B2中5.0 mmol/L L-半胱氨酸添加量為 18.2 mg。

1.2.2精液采集用腹背部聯(lián)合按摩法采集公雞精液，將采得的雞精液用紗布過濾，注意在采集過程中減少糞便、血液、尿酸鹽等的污染。然后將集精瓶用毛巾包好迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，運(yùn)送過程中，且盡量避免振蕩。

1.2.3精液的稀釋和保存分別用稀釋液A0、A1、A2、B0、B1、B2在室溫下將雞精液按照體積比1 ∶[KG-*3]3進(jìn)行稀釋，稀釋后迅速檢查精子活率，然后置于室溫（試驗(yàn)進(jìn)行期間最高室溫27 ℃，最低室溫24.5 ℃）下進(jìn)行保存。測(cè)定精子生存指數(shù)和總存活時(shí)間，即每隔4 h觀察1次活率，直到精子的活率為0時(shí)終止，每個(gè)處理重復(fù)4次。精子生存指數(shù)為相鄰2次精子活率平均數(shù)與間隔時(shí)間乘積的總和，總存活時(shí)間為從觀察開始至精子活率為0時(shí)的累計(jì)時(shí)間和。此外，本試驗(yàn)結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際情況測(cè)定有效生存指數(shù)和有效存活時(shí)間，即指精子的活率為0.6時(shí)的生存指數(shù)和精液保存時(shí)間。

1.2.4精子畸形率精子畸形率是通過用龍膽紫染液染色后的精液抹片在顯微鏡1 000倍油鏡下觀察300個(gè)精子中畸形精子所占的比例。分2次觀察，第1次為在剛稀釋完后即行抹片觀察，第2次為等精子全部死亡時(shí)。

1.3數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007對(duì)原始數(shù)據(jù)作初步整理，然后采用SPSS 170生物統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異顯著標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。[JP]

2結(jié)果與分析

2.1生存指數(shù)和總存活時(shí)間

試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，在添加相同濃度L-半胱氨酸的情況下，用B 稀釋液保存雞精液的精子總存活時(shí)間和生存指數(shù)均顯著高于A稀釋液（P<0.05）。就某一個(gè)稀釋液而言，在A中添加1.0 mmol/L L-半胱氨酸時(shí)，生存指數(shù)均顯著高于不添加和添加5.0 mmol/L L-半胱氨酸等2個(gè)試驗(yàn)組（P<0.05），但總存活時(shí)間以添加5.0 mmol/L L-半胱氨酸最長(zhǎng)，且顯著長(zhǎng)于對(duì)照組和添加1.0 mmol/L L-半胱氨酸試驗(yàn)組（P<0.05）。而在B液中添加1.0、5.0 mmol/L L-半胱氨酸的生存指數(shù)顯著高于未添加組，且以添加5.0 mmol/L L-半胱氨酸的效果最好（P<0.05），總存活時(shí)間表現(xiàn)出與A 稀釋液相同的趨勢(shì)。

2.2有效生存指數(shù)和有效存活時(shí)間

試驗(yàn)結(jié)果（表4）表明，添加相同濃度半胱氨酸的情況下，用B稀釋液保存雞精液的精子有效存活時(shí)間和有效生存指數(shù)均顯著高于A稀釋液（P<0.05）。在A稀釋液中添加10、5.0 mmol/L 半胱氨酸時(shí)，有效生存指數(shù)均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），但2組間無顯著差異（P>0.05）；有效顯存活時(shí)間以添加1.0 mmol/L最長(zhǎng)，且顯著的高于其他2組（P<005）。而在B稀釋液中無論是否添加L-半胱氨酸，其有效生存指數(shù)差異不顯著（P>0.05），但對(duì)于有效存活時(shí)間來說，添加1.0、5.0 mmol/L均顯著高于未添加組（P<0.05）。

2.3保存前后2個(gè)時(shí)期精子畸形率

本試驗(yàn)將巨型精子、短頭精子、雙頭或雙尾精子、頂體膨脹或脫離、精子頭部殘缺或尾部分離等各種精子異常類型均視為畸形，試驗(yàn)結(jié)果（表5）表明，添加相同濃度L-半胱氨酸的情況下，第1次觀察用B 稀釋液保存的雞精液時(shí)，其精子畸[CM（25]形率顯著低于A稀釋液（P<0.05），而第2次兩者之間差異不顯著（P>0.05）。同一種稀釋液而言，2種稀釋液在不添加L-半胱氨酸和添加1 mmol/L L-半胱氨酸時(shí)精子畸形率差異均不顯著（P>0.05），第1次觀察時(shí)A、B等2種稀釋液在不添加L-半胱氨酸和添加1 mmol/L L-半胱氨酸時(shí)精子畸形率顯著低于添加5 mmol/L L-半胱氨酸時(shí)的精子畸形率（P<0.05）；第2次觀察時(shí)，A稀釋液精子畸形率差異均不顯著（P>0.05），B稀釋液在不添加L-半胱氨酸和添加 1 mmol/L L-半胱氨酸時(shí)精子畸形率顯著低于添加5 mmol/LL-半胱氨酸精子畸形率（P<0.05）。

3結(jié)論與討論

從表3、表4可看出，總的趨勢(shì)是添加組的保存效果好于未添加組，且添加量或稀釋液不同，試驗(yàn)結(jié)果也不同。在A稀釋液中，生存指數(shù)以添加1.0 mmol/L時(shí)最高，2個(gè)試驗(yàn)組間的有效生存指數(shù)無顯著差異，但顯著高于對(duì)照組。說明在精液保存前期（精子活率將至60%以前）L-半胱氨酸濃度對(duì)精子機(jī)能影響不大，后期會(huì)有較大影響，在B稀釋液中也表現(xiàn)出類似結(jié)果。造成這一結(jié)果的具體原因還不清楚，須進(jìn)一步研究。精子的存活時(shí)間和稀釋液的氧化還原指數(shù)相關(guān)，精子在氧化還原指數(shù)為0，即在高度無氧的保護(hù)液中保存時(shí)間最長(zhǎng)；在純氧環(huán)境中，精子幾乎不能生存，抗游離氧自由基能力很弱。另外，生物氧化、輻射、污染物侵害、細(xì)胞內(nèi)酶促反應(yīng)等過程中釋放的自由基對(duì)生物分子，尤其是對(duì)脂質(zhì)和核酸有很大的損傷作用，但保護(hù)性酶和抗氧化劑可防止自由基的損害作用[3]。所以，在稀釋液中添加含巰基抗氧化劑的一個(gè)主要目的就是能夠及時(shí)清除精子代謝和外界因素產(chǎn)生的自由基，以達(dá)到對(duì)精子的保護(hù)作用。L-半胱氨酸是一種含有巰基的小分子量氨基酸，是細(xì)胞間谷胱甘肽（GSH）的前體，極易滲入細(xì)胞膜，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外GSH的生物合成，進(jìn)而清除了自由基而保護(hù)了膜內(nèi)的脂類和蛋白質(zhì)。精子在常溫保存過程中會(huì)進(jìn)行緩慢的呼吸代謝活動(dòng)而產(chǎn)生活性氧族，所攜帶的氧自由基氧化性很強(qiáng)，能氧化精子質(zhì)膜的不飽和脂肪酸，干擾精子的代謝，造成過氧化損傷，這就是精子受精能力下降的重要原因[4]。Ravie等報(bào)道，雞和火雞精子中含有多不飽和脂肪酰基[5]，而且雞和火雞精子的體外保存都起過氧化反應(yīng)、精子脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，對(duì)精子具有中毒效應(yīng)[6-7]。Fujihara 等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)會(huì)降低精子活率[8]。從對(duì)火雞精子的研究來看，精子中的抗氧化性沒有足夠高，因此不能夠抑制精子脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，這可以解釋本試驗(yàn)中添加L-半胱氨酸后精液的保存效果明顯好于不添組。

本試驗(yàn)雖未得出對(duì)于A、B等2種稀釋液添加L-半胱氨酸的準(zhǔn)確量，但隨著L-半胱氨酸濃度的增加，保存效果開始變得不明顯，但在不同的稀釋液中這種變化不同，具體來說，在A 稀釋液中添加5 mmol/L L-半胱氨酸時(shí)，除總存活時(shí)間外其他3個(gè)指標(biāo)均有所下降；B稀釋液在同等情況下雖有所上升，但不明顯，說明抗氧化劑的添加量只有在合適的濃度下才能發(fā)揮效果。Blesbois等試驗(yàn)證明，維生素C濃度低時(shí)才具有抗氧化作用，而高濃度的維生素C具有促氧化作用[9]。孫琪證明，在向稀釋液中添加2、4 mmol/L 半胱氨酸均能提高豬精子各項(xiàng)指標(biāo)，更可以維持8 d 60%以上的活率，其中2 mmol/L 半胱氨酸效果更顯著，添加8 mmol/L 半胱氨酸效果則較為不明顯[10]。覃永長(zhǎng)等證明，在250 mL基礎(chǔ)稀釋液中添加0.1 g（在本試驗(yàn)中相當(dāng)于3.3 mmol/L）L-半胱氨酸保存豬精液8 d時(shí)，精子活率還保持在50%以上[11]。李大吉等在冷凍稀釋液中添加1 mmol/L N-乙酰半胱氨酸+0.1 mg/mL L-半胱氨酸（在本試驗(yàn)中相當(dāng)于1.0 mmol/L），解凍后豬精子的平均路徑速度、平均側(cè)擺幅度和平均鞭打頻率最高，運(yùn)動(dòng)的線速度最低，但對(duì)膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)沒有影響，但 0.1 mg/mL L-半胱氨酸處理組可以明顯降低丙二醛（MDA）含量[12]。雖然有很多試驗(yàn)已經(jīng)證明L-半胱氨酸可以有效地保護(hù)精子，降低精子畸形率，但在本試驗(yàn)中可以看出，是否添加L-半胱氨酸對(duì)精子畸形率似乎并沒有多大的改變，這可能是由試驗(yàn)條件造成的，精液來源于不同物種以及稀釋液溶質(zhì)。

本試驗(yàn)通過測(cè)定雞精液保存過程中精子的生存指數(shù)及有效存活時(shí)間可知，在A稀釋液中添加1.0 mmol/L L-半胱氨酸效果較好，但添加5.0 mmol/L L-半胱氨酸時(shí)保存效果會(huì)有所下降；在B稀釋液中添加 1.0 mmol/L L-半胱氨酸與添加5.0 mmol/L L-半胱氨酸的保存效果差異不顯著，但均高于空白對(duì)照組，這種差異可能是由稀釋液的不同造成的。綜上可知，在本試驗(yàn)中影響精子體外存活時(shí)間和有效存活時(shí)間的因素不是某一個(gè)因素造成的，B稀釋液比A稀釋液好，可能是由于B稀釋液中某些成分和L-半胱氨酸共同作用才表現(xiàn)出對(duì)雞精液的體外保存效果，可能是增加了抗氧化劑的作用，但具體機(jī)制還須要進(jìn)一步分析。在進(jìn)行雞精液體外常溫保存時(shí)，添加L-半胱氨酸可以明顯延長(zhǎng)保存時(shí)間，但不同濃度保存效果不相同。

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