復合溶劑預處理對葵花稈木質素去除率和結構的影響

侯彬彬++宋江濤+馬驍+陳福欣+周安寧

摘要：采用NaOH、乙醇復合溶劑對葵花稈進行預處理，通過單因素試驗研究了反應時間、溫度、固液比、溶劑質量分數及復合溶劑比例對葵花稈木質素去除率的影響，然后利用正交試驗法對預處理條件進行優化，得到最佳預處理條件為溫度170 ℃，2% NaOH和70%乙醇的復合溶劑體積比為2 ∶[KG-*3]1，固液比1 ∶[KG-*3]25（g ∶[KG-*3]mL），反應時間1 h，該條件下木質素去除率為53.75%。酶解試驗表明，木質素去除率越高，葡萄糖產率越高。最后通過紅外光譜、掃描電鏡對預處理前后的葵花稈進行結構分析，發現預處理后的葵花稈結構遭到破壞，出現不規則的裂痕，木質素與半纖維素之間的結構被破壞，暴露出更多的纖維素和半纖維素。

關鍵詞：葵花稈；預處理；復合溶劑；酶解；木質素

中圖分類號：TS721+.1；TQ914.1文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2017）03-0136-05

收稿日期：2016-04-28

基金項目：國家自然科學基金（編號：51174279）；教育部博士學科專項基金（編號：20116121110005）。

作者簡介：侯彬彬（1991—），男，陜西榆林人，碩士研究生，主要從事煤炭基精細化學品合成及有機合成研究。E-mail：774716071@qq.com。

通信作者：周安寧，博士，教授，博士生導師，主要從事煤及生物質多聯產轉化與功能材料制備研究。E-mail：psu564@139.com。

中國作為傳統的農業大國，每年葵花稈產量約7億多t[1]。葵花稈作為一種重要的生物綜合利用資源，在農村多數被就地焚燒或棄置腐爛，不僅浪費資源，也污染環境。葵花稈的主要成分為木質素、纖維素等，可作為生產生物質能源的重要原料[2]。在制備生物乙醇方面，關鍵步驟是將纖維素、半纖維素水解為單糖，而在自然狀態下，木質素像保護層一樣包圍在纖維素和半纖維素之間，且有很高的結晶度[3]，導致纖維素酶對其水解能力變弱，所以有必要對葵花桿進行木質素脫除。對秸稈木質素進行預處理的方法較多，較早的方法是機械處理法[4]，但成本高；蒸汽爆破處理法[5-6]木質素轉化及半纖維素溶解效果好，但易產生有毒物質；微波加熱法速率快，所需能量少[7]，可以破壞纖維素的結晶區，降低表皮木質素含量[8]，但對酶水解促進作用小；生物法主要利用白腐菌、褐腐菌、軟腐菌、木腐菌對秸稈木質素進行預處理[9-12]，其優點是條件溫和，環境友好，但缺點是受菌種及其分泌酶狀況的影響，且處理周期長，水解得率較低；堿法可以發生溶劑化、皂化作用，導致生物質膨脹，可有效脫除木質素，與酸法比較，對纖維素、半纖維素的破壞程度較輕，而且會導致纖維素變得比天然纖維素更致密、穩定[13-14]。Mathew等開展了NaOH預處理油菜秸稈用于評價葡萄糖產率的研究，發現堿預處理比酸預處理效果好，堿預處理下產率為44%左右[15]。有機溶劑能斷裂秸稈內部木質素與纖維素之間的酯鍵，增大葡萄糖產率[16]，還可通過減壓蒸餾進行回收，降低成本，且提取的木質素純度高，可避免阻礙微生物生長、酶法水解和發酵的化合物生成[17]。Neilson等使用乙醇預處理來脫除木質素，可以提高木材的酶解率[18]。雖然各種預處理方法各有優勢，但單一的預處理方式有局限性，文獻中也多次報道組合試劑法，Dai等采用NaOH、尿素對水稻秸稈預處理，發現其有協同效應，明顯提高了糖產率[19]。He等用離子液體 1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽與NaOH處理玉米秸稈，酶促水解 2 d，生物質轉化成還原糖的產率為95.1%[20]。基于溶劑法和堿法的各自優勢，嘗試選用復合溶劑法進行葵花稈的預處理。本研究選用NaOH、乙醇復合溶劑對葵花稈進行預處理，研究預處理時間、溫度、固液比、堿醇比以及堿和乙醇濃度對木質素去除率的影響，并通過正交試驗確定最佳條件，比較復合溶劑與單溶劑預處理對葵花稈酶解制糖的影響，以期提高木質素的去除率，進一步提高酶解制糖產率。

1材料與方法

1.1材料及儀器

材料：葵花稈取自陜西省神木縣，用粉碎機粉碎后過 40～80目篩，主要成分如下：水分12.51%、綜纖維素4884%、木質素13.26%、灰分4.24%；纖維素酶來源于黑曲霉（載體為淀粉），粉末，購自于阿拉丁公司；氫氧化鈉、無水乙醇、葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸、檸檬酸鈉、檸檬酸、鹽酸、丙酮、硫酸均為分析純。

儀器：恒溫油浴鍋（DF-101S型），離心機（SK-1型），恒溫水浴振蕩器（DKZ系列），鼓風干燥箱（101-3型），旋轉蒸發器（RE-2000B型），電子天平（FA-2004型），雙光束紫外可見分光光度計（TU-1901型），馬弗爐（XSI-25-1200型），傅里葉紅外光譜儀（EQUINOX55型），掃描電鏡（JSM 6460 LV型）。

1.2葵花稈預處理

取一定量葵花稈，在鼓風干燥箱中烘干至恒質量。取2 g葵花稈置于三口燒瓶中，加入預處理液，在一定溫度下反應一段時間。反應結束冷卻至室溫后抽濾，用超純水將濾餅洗滌至中性，收集濾液、濾餅。濾餅在105 ℃下烘干至恒質量。濾液用旋轉蒸發儀減壓蒸餾，回收乙醇，然后在濾液中加入濃硫酸使木質素析出沉淀，最后回收木質素，木質素去除率計算方法如下：

[JZ（]木質素去除率=[JB（（]1-[SX（]溶劑法處理后木質素質量葵花稈中木質素質量[SX）][JB））]×100%。[JZ）][JY]（1）

1.3濾紙酶活力的測定

參照QB 2583—2003《纖維素酶制劑》的方法配制DNS試劑、檸檬酸緩沖液、葡萄糖標準貯備溶液（10 mg/mL）及葡萄糖標準使用溶液，繪制葡萄糖標準曲線。參照QB 2583—2003《纖維素酶制劑》的方法，制備待測酶樣和濾紙條，利用下式計算濾紙酶活力：

[JZ（]X1=A×1/0.5×n。[JZ）][JY]（2）

式中：X1為濾紙酶活力（FPA）；A為由測得吸光度計算的還原糖量；1/0.5為酶液的稀釋倍數。

1.4酶解試驗

分別取50 mg未經處理的葵花稈、經2% NaOH溶液處理、經70%乙醇溶液處理、經2% NaOH溶液和70%乙醇溶液協同處理的葵花稈各4組，共16組于試管內，對其進行編號。在每只試管中加入一定量檸檬酸緩沖液和90 U/g的纖維素酶，混勻，蓋塞，置于50 ℃的恒溫水浴振蕩器中酶解，每隔 12 h 各取4種原料中的1支試管，加入DNS試劑，在沸水浴中加熱10 min使酶失活。然后在冷水浴中使其降到室溫，加水至25 mL混勻，使用雙光束紫外可見分光光度計測定溶液在波長540 nm下的吸光度，將該吸光度代入標準葡萄糖曲線的線性回歸方程，計算出葡萄糖產量。

2結果與分析

2.1各因素對葵花稈木質素去除率的影響

2.1.1水解溫度、水解時間對木質素去除率的影響

水解溫度選擇：稱取2 g葵花稈，加入90%乙醇、2% NaOH復合溶劑（V ∶[KG-*3]V=1 ∶[KG-*3]1）40 mL，分別在140、150、160、170 ℃下水解 1 h，測其木質素去除率。如圖1-a所示，隨著溫度升高，木質素去除率不斷提高，但是當溫度進一步提高時，木質素去除率上升緩慢。說明隨著溫度升高，預處理反應越來越劇烈，溫度到160 ℃時反應劇烈程度趨于飽和，所以木質素去除率的上升速率變慢。

水解時間選擇：稱取2 g葵花稈，加入90%乙醇、2% NaOH復合溶劑（V ∶[KG-*3]V=1 ∶[KG-*3]1）40 mL，在160 ℃下，分別水解0.5、1.0、1.5、2.0 h，測其木質素去除率。如圖1-b所示，隨著處理時間延長，木質素去除率呈現迅速增大而后趨于平緩增長的趨勢。處理時間越長，木質素去除率越高。當處理時間超過1.5 h后，反應液中的木質素含量趨于飽和，時間過長可能會阻止木質素的繼續溶出。

2.1.2溶劑質量分數、體積分數對木質素去除率的影響

乙醇體積分數選擇：稱取2 g葵花稈，分別加入60%、70%、80%、90%乙醇和2% NaOH的復合溶劑（V ∶[KG-*3]V=1 ∶[KG-*3]1）40 mL，在160 ℃下水解1 h，測其木質素去除率。如圖2-a所示，隨著乙醇濃度增大，木質素去除率先升高后降低，當乙醇體積分數為70%時，木質素去除率最高。這與有機溶劑乙醇破壞了木質素之間的連接鍵、半纖維素之間的糖苷鍵以及木質素和半纖維素之間的醚鍵、4-O-甲基葡萄糖醛酸酯鍵，加速木質素的溶出有關，所以乙醇體積分數不宜過高或過低，結合實際生產成本，選擇乙醇體積分數為70%。

[JP+1]NaOH質量分數選擇：稱取2 g葵花稈，分別加入70%乙醇和0.5%、1.0%、2.0%、3.0% NaOH的復合溶劑（V ∶[KG-*3]V=1 ∶[KG-*3]1） 40 mL，在160 ℃下水解1 h，測其木質素去除率。如圖2-b所示，隨著NaOH濃度增大，木質素去除率不斷上升，但是上升趨勢不斷減緩。氫氧化鈉導致木質素膨脹、纖維素內表面積增加以及聚合度和結晶度降低，從而引發木質素結構的斷裂，考慮到實際成本，選擇NaOH溶液濃度為2.0%。

2.1.3固液比和復合溶劑體積比對木質素去除率的影響

固液比選擇：稱取2 g葵花稈，分別加入70%乙醇、2% NaOH復合溶劑（V ∶[KG-*3]V=1 ∶[KG-*3]1）30、40、50、60 mL，在160 ℃下水解 1 h，測其木質素去除率。如圖3-a所示，隨著固液比的增加，木質素去除率先升高后緩緩下降。由于乙醇可以溶解木質素，因此增大固液比有利于木質素的溶出，但到一定程度就會飽和。當固液比為1 ∶[KG-*3]25（g ∶[KG-*3]mL）時，木質素去除率最高。

乙醇與NaOH體積比的選擇：稱取2 g葵花稈，分別加入70%乙醇、2% NaOH復合溶劑（V ∶[KG-*3]V=1 ∶[KG-*3]0、2 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]2、0 ∶[KG-*3]1）40 mL，在160 ℃下水解1 h，測其木質素去除率。如圖3-b所示，單獨用2種溶液進行預處理時，木質素去除率很低；當2種溶液進行復合處理時，木質素去除率有較大提升，說明復合溶劑有協同作用，當乙醇溶液與NaOH溶液體積比為1 ∶[KG-*3]2時，木質素去除率最高。

2.1.4正交試驗

根據單因素試驗結果，分別將NaOH濃度、乙醇濃度確定為2%、70%，將考察因素定為溫度、時間、復合溶劑（2% NaOH、70%乙醇）比例、固液比，采用L9（34）正交表進行試驗，因素水平見表1，正交試驗結果見表2。

由表2可知，4個因素對葵花稈木質素去除率影響大小次序為時間>復合溶劑體積比>固液比>溫度。優化得到的最佳條件為A3B2C1D1，即加熱溫度170 ℃，時間1 h，2% NaOH、[JP2]70%乙醇體積比2 ∶[KG-*3]1，固液比為1 ∶[KG-*3]25（g ∶[KG-*3]mL）。使用該最優條件進行試驗驗證，得到的木質素去除率為 53.75%，高于表2中所有結果，驗證了正交試驗結果的正確性。

2.2葵花稈預處理前后的結構變化

2.2.1紅外光譜分析

從圖4可以看出，水解前后的葵花稈紅外譜圖基本相似，3 370 cm-1為分子內羥基O—H伸縮振動譜帶，2 920 cm-1為—CH、—CH2伸縮振動的吸收峰，波數 1 720～1 733 cm-1處的吸收峰表征與木質素或半纖維素有關的非共軛酮基、羰基及酯鍵的C[FY=，1]O伸縮振動[21]，1 650 cm-1處的吸收峰由木質素中共軛羰基伸縮振動所導致[22]。經預處理后，發現其特征吸收峰基本消失不見，說明木質素的結構被破壞，1 510 cm-1為木質素苯環骨架振動的特征吸收峰，經預處理后也基本消失，說明脫出了木質素。1 250 cm-1愈創木基的苯環伸縮振動引起，1 060～1 062 cm-1為葵花稈的中纖維素與半纖維素的特征光譜帶，897 cm-1為纖維素中 β-D-葡萄糖苷的特征峰[23-24]，預處理的特征峰與原樣品相比有了更明顯的變化，這可能是因為經過堿和有機溶劑協同預處理，斷裂了木質素與半纖維素間的連接鍵，使部分木質素得以去除。消除了木質素的包裹，纖維素和半纖維素暴露出來的部分越來越多，所以其特征峰更加明顯。

2.2.2掃描電鏡分析

在植物細胞壁中，纖維素被木質素伸展蛋白、半纖維素、果膠質組成的基質所包埋，這樣可以增強植物細胞壁的抗拉強度和機械性能，所以在圖5-a中所看到的葵花稈結構致密，纖維素緊密排列在一起，高度有序。如圖5-b所示，經過氫氧化鈉、乙醇復合溶劑預處理后，葵花稈結構被破壞，表面出現不規則的裂痕和孔洞、褶皺，大量木質素被降解，木質素與半纖維素之間的空間立體交聯結構被破壞，內部纖維素骨架顯現，暴露出更多纖維素[25]，比表面積增大，纖維素酶與纖維素的接觸面增加，增大了酶解制糖的產率。

2.3不同預處理方法對葵花稈酶解制糖的影響

以吸光度為縱坐標，葡萄糖含量為橫坐標，繪制葡萄糖標準曲線（圖6），回歸方程為y=0.229 2x+0.009 6，線性回歸系[CM（25]數為r2=0.999[KG*3]01。通過測定分析得出，本試驗所用的纖維素濾紙酶活力為546 U/g。

以未處理的葵花稈、經過2% NaOH預處理的葵花稈、70%乙醇預處理的葵花稈、2% NaOH和70%乙醇協同預處理的的葵花稈為原料進行酶解試驗。由圖7可知，所有曲線都呈上升趨勢，并且上升速率越來越小。未經過預處理的葵花稈相關曲線上升幅度和速率都最小，可能是由于木質素的阻擋，酶與纖維素接觸受阻，酶解率也低。對于單溶劑來說，利用2% NaOH處理的葵花稈，其葡萄糖產率比70%乙醇處理的葵花稈稍高一些，這是由于2% NaOH預處理葵花稈時，其木質素脫除率略高于70%乙醇溶劑。用2% NaOH、70%乙醇共同預處理葵花稈，其葡萄糖產率明顯比單一溶劑預處理的效果好，這是由于用混合溶劑預處理葵花稈時，木質素的脫除率最高。

[FK（W13][TPHBB7.tif][FK）]

3結論

本研究表明，2% NaOH、70%乙醇復合溶劑預處理葵花稈時，木質素去除率顯著高于2%氫氧化鈉或70%乙醇溶劑單獨處理；通過正交試驗優化后的最佳預處理條件是：加熱溫度170 ℃，時間1 h，2% NaOH溶液、70%乙醇體積比為2 ∶[KG-*3]1，固液比為1 ∶[KG-*3]25（g ∶[KG-*3]mL），該條件下木質素去除率為 53.75%；葵花稈預處理后，其木質素去除率越高，酶解后葡萄糖的產率越高。

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