太湖底泥中聚磷菌多樣性的垂直分布

錢瑋++朱艷霞++邱業先

摘要：以太湖不同深度底泥為研究對象，采用末端限制性片段長度多態性方法，分析底泥中聚磷菌的多樣性。結果表明：32～35 cm底泥中聚磷菌多樣性最高，物種豐度、Shannon-Weiner多樣性指數分別為10、1.94。下層底泥（12～15、22～25、32～35 cm）中聚磷菌的群落結構趨于穩定，表層底泥（0～3、6～8 cm）受泥水界面影響，聚磷菌群落結構與下層底泥有明顯差異。研究結果為了解湖泊底泥微生物的分布和聚磷菌多樣性積累了有價值的資料。

關鍵詞：太湖底泥；聚磷菌；末端限制性片段長度多態性（T-RFLP）；垂直分布；微生物

中圖分類號：X172文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2017）03-0221-03

收稿日期：2015-12-21

基金項目：蘇州科技學院科研基金（編號：XKQ201313）。

作者簡介：錢瑋（1983—），男，江蘇泰州人，碩士，實驗師，研究方向為環境微生物學。Tel：（0512）68183945；E-mail：qianwei@mail.usts.edu.cn。

聚磷菌（polyphosphate accumulating organisms，簡稱PAOs）別稱攝磷菌，是一類對磷超量吸收的細菌菌種，磷以聚磷酸鹽顆粒（異染粒）的形式存在于細胞內，聚磷菌不是單一的微生物而是由不同的微生物群落組成[1]。研究表明，多聚磷酸鹽在聚磷菌聚磷過程中起著關鍵作用。多聚磷酸鹽（polyphosphate，簡稱Poly-P）是由無機正磷酸鹽殘基通過高能磷酸鍵連接而成的線性多聚物。近十年來，國外已有不少研究者對聚磷菌中與Poly-P的合成和分解有關的關鍵基因多聚磷酸鹽激酶（polyphosphate kinase，簡稱PPK）和外切聚磷酸酶（ex-opolyphosphatase，簡稱PPX）基因進行克隆表達，在國內相關研究剛剛起步，理解聚磷菌磷酸鹽轉運和代謝的生化機制和遺傳學知識，試圖從基因角度發現它們在遺傳學和酶學上是如何調控的，對于改進聚磷菌的廢水除磷能力是十分必要的[2]。

研究聚磷菌最傳統的方法是分離培養法，但這種方法只能研究單一菌種特性，無法對生境中聚磷菌群落組成和動態變化進行綜合分析，而分子生物學技術打破了傳統的生物學方法存在的缺陷，使從宏觀角度分析聚磷菌群落特征成為可能。本研究選用太湖竺山湖段生活污水入水口底泥為材料，采用基于PCR的分子指紋圖譜技術——限制性末端片段長度多態性（terminal-restriction fragment length polymorphism，簡稱T-RFLP）分析太湖生活入水口不同深度底泥聚磷菌群落多樣性，旨在探究該地區底泥中聚磷微生物的群落結構，同時也為以微生物為基礎的環境監測預警和評價提供理論依據[3]。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1樣品采集

底泥樣品于2012年5月29日采集，采樣點位于太湖竺山湖（地理位置31°28′55″N，120°04′94″E）。以采樣點為中心作邊長10 m等邊三角形，利用沉積物柱狀采樣器，從3個頂點采集0～50 cm深度底泥樣品，把3份底泥樣品分別按照0～3、6～8、12～15、22～25、32～35 cm深度分成5段，將每段同一深度的底泥混勻，存放于-20 ℃冰箱待用[4]。

1.1.2試劑

PCR擴增試劑盒、DNA膠回收試劑盒、限制性內切酶TaqⅠ、PCR引物等均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3儀器

GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）、5417R小型臺式高速離心機（德國Eppendorf公司）、Universal Hood Ⅱ凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad）、5332PCR擴增儀（德國Eppendorf公司）、HHoS21-4-S恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）、YXQ-LS-50SII高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業有限公司）。

1.2試驗方法

1.2.1底泥DNA提取

底泥總DNA提取參照朱艷霞等的方法[5]，略有改動。稱取3 g底泥樣品于10 mL離心管中，加入6 mL DNA提取液，渦旋混勻5 min。加入溶菌酶至終濃度為2 mg/mL，搖床37 ℃、225 r/min振蕩1 h。加入10%體積20%十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，簡稱SDS），混勻后于65 ℃水浴2 h，其間每15 min輕輕顛倒混勻。室溫 8 000 r/min 離心10 min收集上清，上清中加50%體積的40%聚乙二醇-8 000（polyethylene glycol，簡稱PEG）混勻，4 ℃ 沉淀過夜。4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集沉淀。沉淀用600 μL TE緩沖液溶解，加入等體積的酚-三氯甲烷-異戊醇（25 ∶[KG-*3]24 ∶[KG-*3]1），4 ℃、12 000 r/min離心10 min收集上清。加入等體積的三氯甲烷-異戊醇（24 ∶[KG-*3]1），4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，收集上清。加入10%體積的 5 mol/L 乙酸鈉和60%體積-20 ℃預冷的異丙醇室溫沉淀 4 h，4 ℃、12 000 r/min離心15 min棄上清。沉淀用 -20 ℃ 預冷的70%乙醇洗滌2次，沉淀晾干后加200 μL TE緩沖液溶解，收集于1.5 mL離心管中。[JP2]

1.2.2聚磷菌的PCR擴增

PCR上游引物PPK1（5′-FAM-[JP]AAYYTNGAYGARTTYTTYATGGT-3′），PCR下游引物PPK2（5′-GTCGAGCAGTTTTTGCATGA-3′）。PCR反應為20 μL體系：10 μL 2×Premix，各1 μL上下游引物，1 μL模板DNA，7 μL ddH2O。PCR反應條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，48.5 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個循環；72 ℃ 10 min[6-7]。

1.2.3PCR產物的純化與限制性酶切

按照說明書，使用DNA膠回收試劑盒純化PCR產物。采用TaqⅠ限制性內切酶同時對PCR產物進行酶切。限制性酶切體系包含PCR純化產物10 μL，10×buffer （TaqⅠ） 1 μL，TaqⅠ酶1 μL。65 ℃ 酶切4 h后將產物送上海基康生物技術有限公司進行基因掃描。

1.2.4數據分析

T-RFLP圖譜分析采用Treeflap軟件[8]，峰值圖上峰的橫坐標代表T-RF的片段長度；峰的面積則代表具有相同片段長度所有T-RF的熒光強度的總和，即它所代表的這種菌種的相對豐度，然后分別計算樣本的物種豐度（species richness）、多樣性指數（Shannon-Weiner index）、優勢度指數（Simpson index）和均勻度指數（Pielou evenness）。樣品聚類分析使用SPSS 15.0軟件。

2結果與分析

2.1聚磷菌的PCR擴增

以不同深度底泥提取的基因組DNA為模板，采用針對聚磷菌的PPK特異性引物進行擴增。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，獲得了長度約為600 bp的目的條帶（圖1）。

2.2聚磷菌T-RFLP圖譜分析

PCR產物經雙酶切后進行基因掃描，得到0～3、6～8、12～15、22～25、32～35 cm深度底泥聚磷菌群落多樣性T-RFLP圖譜（圖2）。T-RFLP圖譜用Treeflap軟件進行分析，選擇的內標為GS500liz和sizing defalt-pp，舍去小于35 bp和大于500 bp的片段，取熒光強度大于1 000 RFU的峰，得到不同深度底泥優勢菌群的種類及數量（圖3）。[FL）]

從圖2、圖3中可以看出，不同深度底泥中聚磷菌種類不同，檢測到的T-RFs片段長度主要集中在35～43 bp和 177～186 bp段。179 bp所代表的聚磷菌在所有樣品中普遍存在，且在各樣品中含量基本相當。35～43 bp段所代表的微生物存在于0～3、22～25、32～35 cm等3個深度底泥樣品中，在6～8、12～15 cm深度的底泥中未能檢測到。180 bp所代表的聚磷菌存在于除去0～3 cm段的其他4個深度的樣品中，且在各樣品中比例較大，可能是因為該聚磷菌能夠穩定地存在于底泥中，但其生長受水體影響較明顯，無法存在于最表層底泥中。

2.3不同深度底泥聚磷菌多樣性比較分析

根據不同深度底泥聚磷菌群落豐度（圖4-A）可以看出，不同深度的底泥中聚磷菌數量差異不大，底層和表層泥中聚磷菌種類相對較豐富。從Shannon-Weiner指數（圖4-B）可以看出，最底層聚磷菌群落多樣性最大，群落最復雜；0～15 cm段隨著深度的增加，聚磷菌多樣性減少，而15～35 cm 多樣性逐漸增多。均勻度（Pielou）指數表明，不同深度底泥聚磷菌群落均一性差異明顯，0～8 cm段聚磷菌均一性隨著深度的增加而增強，8～35 cm段聚磷菌均一性隨著深度增加而減弱（圖4-C）。Simpson指數表明，不同深度聚磷菌群落優勢度存在明顯的差異，其中12～15 cm深度處聚磷菌的Simpson指數最高，說明該點的不同聚磷菌豐度相差不大，而深層底泥中聚磷菌分布極不均勻（圖4-D）。[FL）]

[FK（W18][TPQW4.tif][FK）]

2.4聚磷菌群落結構的聚類分析

對5個不同深度底泥的T-RFLP圖譜進行聚類分析，由圖5可以看出，12～15、22～25、32～35 cm聚類為1組，它們所含聚磷菌群落結構相近，與0～3、6～8 cm段樣本的相似度較差。這一結果也從側面反映了不同深度的底泥樣品中聚磷菌群落結構與細菌群落結構的變化具有一致性[9]。

3結論與討論

太湖底泥中最底層聚磷菌種類、多樣性最多，分別為10、1.94，群落較復雜。不同深度聚磷菌群落優勢度和均勻度存在明顯的差異，其中15 cm深度處聚磷菌種類分布比較均一，而深層底泥中聚磷菌豐度差異性逐漸增大。各樣品中 T-RFs 片段長度主要集中在35～43、177～186 bp段，難以進行區分。可能原因是PPK引物擴增得到DNA片段中有較長的保守序列，使得酶切片段比較集中，后續可以嘗試更換引物以及通過雙酶切以增加T-RFs多樣性[10]。

通過聚類分析發現，下層底泥（12～15、22～25、32～35 cm）中聚磷菌的群落結構趨于穩定，與0～3、6～8 cm段樣品所含聚磷菌種類相似度較差，可能原因是表層底泥位于泥水界面，其中磷的含量和形態變化受泥水界面擾動較大，由此造成其中聚磷菌群落結構與底層差異較大[11]。

[HS2*3]參考文獻：

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[2]Majed N，Du Y，Gu A Z. Analysis of phosphorus fractions in EBPR process and metabolic link with polyphosphate[J]. Proceedings of the Water Environment Federation，2010（9）：7109-7116.

[3]Disayathanoowat T，Young J P W，Helgason T，et al. T-RFLP analysis of bacterial communities in the midguts of Apis mellifera and Apis cerana honey bees in Thailand[J]. FEMS Microbiology Ecology，2012，79（2）：273-281.

[4]袁和忠，沈吉，劉恩峰，等. 太湖水體及表層沉積物磷空間分布特征及差異性分析[J]. 環境科學，2010，31（4）：954-960.

[5]朱艷霞，邱業先，錢瑋. 一種適用于太湖底泥基因組DNA的提取方法[J]. 江蘇農業科學，2012，40（7）：31-33.

[6]McMahon K D，Jenkins D，Keasling J D. Polyphosphate kinase genes from activated sludge carrying out enhanced biological phosphorus removal[J]. Proceedings of the Water Environment Federation，2001（16）：20-33.

[7]McMahon K D，Yilmaz S，He S，et al. Polyphosphate kinase genes from full-scale activated sludge plants[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2007，77（1）：167-173.

[8]Antunes P M，Koch A M，Dunfield K E，et al. Influence of commercial inoculation with Glomus intraradices on the structure and functioning of an AM fungal community from an agricultural site[J]. Plant and Soil，2009，317（1/2）：257-266.

[9]朱艷霞. 太湖入水口底泥微生物宏基因組及聚磷菌多樣性研究[D]. 蘇州：蘇州科技學院，2012.

[10][JP2]王荻，徐革鋒，劉洋，等. 兩種雙酶切組合在細鱗魚AFLP體系中的比較分析[J]. 大連海洋大學學報，2009，24（5）：459-464.[JP]

[11]李大鵬，黃勇，李偉光，等. 底泥擾動對上覆水中磷形態分布的影響[J]. 環境科學學報，2009（2）：279-284.