miR-15a在子宮內膜癌組織中的表達變化及臨床意義

邵田

·論著·

miR-15a在子宮內膜癌組織中的表達變化及臨床意義

邵田

目的 探討miR-15a在子宮內膜癌組織中表達變化及臨床意義，分析miR-15a在子宮內膜癌發(fā)生發(fā)展過程中的可能機制。方法 通過熒光定量PCR法測定68例子宮內膜癌組織和68例癌旁組織的miR-15a表達情況；分別將無關序列模擬物(非轉染組)、miR-15a模擬物(轉染組)轉染入RL95-2人子宮內膜癌細胞，設立陰性對照組，比較3組的miR-15a和基質金屬蛋白酶2(MMP-2)表達情況；并通過Transwell腫瘤細胞侵襲試驗和Transwell腫瘤細胞遷移試驗檢測RL95-2細胞的侵襲力和遷移能力。結果 子宮內膜癌組織miR-15a相對表達量明顯低于癌旁組織(P<0.05)； miR-15a相對表達量與子宮內膜癌患者的FIGO分期、淋巴結轉移、肌層浸潤程度、分化程度相關(P<0.05)；轉染組miR-15a相對表達量明顯高于未轉染組和對照組，MMP-2相對表達量明顯低于未轉染組和對照組(P<0.05)；轉染組侵襲力與遷移力均明顯低于未轉染組和對照組(P<0.05)。結論 在子宮內膜癌患者中miR-15a以低表達為主，且與淋巴結轉移、分化程度、肌層浸潤程度、FIGO分期有關，miR-15a作為抑癌基因可能是通過抑制MMP-2蛋白發(fā)揮抑制癌細胞轉移及侵襲的作用。

子宮內膜癌；miR-15a；表達水平；轉移侵襲；分析

子宮內膜癌是對女性群體身心健康和生命威脅極大的惡性腫瘤之一，病死率及發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年上升，且有趨向年輕化的趨勢[1]。近幾年，分子生物學標記物在惡性腫瘤患者診斷及預后評估中得到了廣泛應用。微小RNAs(miRNA)為內源性小分子RNA的一種，在轉錄水平上能夠調控相關基因表達來起到調節(jié)生物學功能的作用[2]。相關研究指出，miRNA與細胞的凋亡、生長、增殖等過程有關，而且與惡性腫瘤、肝膽疾病、心血管疾病等的發(fā)生及進展有一定關系[3,4]。其中，miR-15a為miRNA家族中的一個重要成員，屬于一種較為保守的miRNA，無法直接無法編碼相關蛋白。部分研究顯示，miR-15a與肺癌、結腸癌等的轉移、浸潤過程密切相關[5]。基于此，本研究探討了miR-15a在子宮內膜癌組織中表達變化及臨床意義，分析miR-15a在子宮內膜癌發(fā)生發(fā)展過程中的可能機制。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年5月至2016年5月我院收治的子宮內膜癌患者的資料，病歷資料完整且取得子宮內膜癌組織和癌旁組織石蠟切片的患者納入本研究，共入選68例患者。入選標準：(1)均行手術治療；(2)行手術治療前均未進行放化療或者其他輔助治療；(3)病歷資料保存完整者。排除標準：(1)伴有遠處轉移者；(2)復發(fā)患者。68例患者中，年齡48～73歲，平均年齡(55.9±7.2)歲；國際婦產科聯(lián)盟(FIGO)制定的分期[6]：Ⅰ期18例，Ⅱ期26例，Ⅲ期14例，Ⅴ期10例；分化程度：G1者31例，G2者23例，G3者14例；病理類型：子宮內膜樣內膜癌61例，漿乳癌或透明細胞癌7例；肌層浸潤深度：≤1/2者51例，>1/2者17例；有淋巴結轉移15例，無淋巴結轉移53例。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑:RL95-2人子宮內膜癌細胞(上海康朗生物科技有限公司生產)，實時熒光定量PCR儀及其試劑盒(美國BioRad公司生產)，LipofectamineTM2000細胞轉染試劑盒、總RNA提取試劑盒TRIzol(美國Roche公司生產)，0.25%胰酶、PBS、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司生產)，miR-15a片段的設計與合成由上海研域生物工程有限公司完成，NanoDrop2000 型紫外分光光度計(美國Merinton公司生產)。

1.2.2 子宮內膜癌組織與癌旁組織miR-15a檢測:通過熒光定量PCR法測定子宮內膜癌組織和癌旁組織的miR-15a表達情況，取總RNA提取試劑盒對子宮內膜癌組織和癌旁組織的RNA進行提取，取紫外分光光度儀檢測所提取RNA的濃度及純度，A260/A280值≥1.8的樣品進行測定；把RNA逆轉錄合成為cDNA，進行miR-15a基因擴增，以U6作為內參行定量PCR法檢測，上游因為為5’-TAGCAGCACATAATGGTTTGTG-3’，下有引物為試劑盒中通用引物；取PCR儀進行PCR測定，反應程序為90℃變性60 s，95℃變性10 s，74℃變性15 s，共進行36個循環(huán)，以2-ΔΔCt計算子宮內膜癌組織和癌旁組織的miR-15a的相對表達量。所有試驗均重復3次。

1.2.3 RL95-2細胞培養(yǎng)和miR-15a基因的轉染:取RL95-2細胞株放于DMEM培養(yǎng)基中，置于5% CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，溫度控制在37℃，取0.25%胰酶進行消化和傳代，以對數(shù)生長細胞進行轉染；分別將無關序列模擬物(非轉染組)、miR-15a模擬物(轉染組)轉染入RL95-2人子宮內膜癌細胞，嚴格按照LipofectamineTM 2000細胞轉染試劑盒說明進行，設立陰性對照組，轉染8 h后把所有細胞放置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有試驗均重復3次。

1.2.4 RL95-2細胞miR-15a檢測:通過熒光定量PCR法測定RL95-2細胞miR-15a的相對表達量，取總RNA提取試劑盒提取轉染48 h的RL95-2細胞，余步驟和相對表達量計算參照1.2.2進行。所有試驗均重復3次。

1.2.5 RL95-2細胞侵襲能力檢測:通過Transwell腫瘤細胞侵襲試驗對RL95-2細胞侵襲能力進行測定，將保存于-20℃冰箱中的基質膠取出后于4℃下過夜融化，取培養(yǎng)基將其稀釋至1 mg/ml，取50 μl的培養(yǎng)基經孵育后凝固備用；將4×105個轉染24 h的細胞重懸于無血清的培養(yǎng)基中，取細胞混合液貼壁置于小室的上層，取含有20%的FBS的培養(yǎng)基加入至小室的下層，在濃度為5%、溫度為37℃的CO2條件中培養(yǎng)18 h，取出小室，去除培養(yǎng)基，擦去上層細胞，取PBS進行沖洗，用甲醇進行5 min固定，取結晶紫染色15 min，取清水浸洗，晾干后封片，于100倍鏡下抽取5個視野進行計數(shù)。所有試驗均重復3次。

1.2.6 RL95-2細胞遷移能力檢測:用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液將非轉染組、轉染組、對照組細胞以5×105/ml的密度接種于6孔板中, 待細胞生長至80%左右，將培養(yǎng)液換為無血清的DMEM 24 h，用200 μl 的槍頭在單層細胞上劃痕, 用PBS洗1遍, 加無血清培養(yǎng)液中24 h，用倒置顯微鏡于40倍鏡下觀察24 h后細胞由劃痕邊緣向劃痕內遷移的細胞數(shù)。所有試驗均重復3次。

1.2.7 RL95-2細胞基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)檢測:通過Westernblotting法對RL95-2細胞MMP-2表達情況進行測定。所有試驗均重復3次。

1.3 觀察指標 (1)比較子宮內膜癌與癌旁組織miR-15a相對表達量；(2)比較子宮內膜癌不同臨床病理指標患者miR-15a相對表達量；(3)比較不同組別的miR-15a和MMP-2相對表達量；(4)比較不同組別的細胞侵襲力和遷移力。

2 結果

2.1 子宮內膜癌與癌旁組織miR-15a相對表達量比較 子宮內膜癌組織miR-15a相對表達量明顯低于癌旁組織(P<0.05)。見表1。

表1 子宮內膜癌與癌旁組織miR-15a相對表達量比較 ±s

2.2 不同臨床病理指標患者miR-15a相對表達量比較miR-15a相對表達量與子宮內膜癌患者的FIGO分期、淋巴結轉移、肌層浸潤程度、分化程度相關(P<0.05)，與年齡、病理類型無關(P>0.05)。見表2。

表2 不同臨床病理指標患者miR-15a相對表達量比較 ±s

2.3 不同組別miR-15a和MMP-2相對表達量比較 轉染組miR-15a相對表達量明顯高于未轉染組和對照組，MMP-2相對表達量明顯低于未轉染組和對照組(P<0.05)；未轉染組、對照組的miR-15a和MMP-2相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

組別miR-15aMMP-2轉染組 8.72±2.631.65±0.61未轉染組3.58±1.84*4.65±2.18*對照組 3.64±1.98*4.59±2.02*

注: 與轉染組比較，*P<0.05

2.4 不同組別細胞侵襲力與遷移力比較 轉染組侵襲力與遷移力均明顯低于未轉染組和對照組(P<0.05);未轉染組、對照組的細胞侵襲力與遷移力比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4，圖1、2。

表4 不同組別細胞侵襲力與遷移力比較 n=3,個±s

注: 與轉染組比較，*P<0.05

3 討論

目前，在子宮內膜癌患者中以藥物聯(lián)合手術的綜合治療方案取得了顯著效果，尤其是一些早期患者的預后得到明顯改善。不過臨床顯示，17%～51%的子宮內膜癌患者會發(fā)生遠處轉移，6%～21%出現(xiàn)局部復發(fā)，而復發(fā)轉移是導致子宮內膜癌患者死亡的主要因素[7]。因此，積極探尋反映子宮內膜癌患者病理過程的相關分子標志物，對降低病死率具有重要意義。腫瘤細胞轉移、侵襲、浸潤是惡性腫瘤最本質的表現(xiàn)和重要標志，也是導致患者預后較差的主要因素；腫瘤細胞轉移、侵襲、浸潤也是一個多步驟、連續(xù)性的生物學過程，這需要多種生長因子、細胞因子等共同作用完成，對惡性腫瘤細胞轉移、侵襲、浸潤等機制開展相關研究，有助于為患者生物治療提供一個作用靶位[8]。miR-15a位于人染色體的13q14處，屬于miRNA的一個重要類型。既往研究證實，miR-15a為抑癌基因的一種，在大多數(shù)惡性腫瘤當中不表達或者低表達[9]。

對照組未轉染組轉染組

圖1 3組細胞侵襲力比較(結晶紫染色×100)

對照組未轉染組轉染組

圖2 3組細胞遷移力比較(×40)

在本研究中，子宮內膜癌組織中miR-15a的相對表達量要明顯低于癌旁組織。研究結果提示，在子宮內膜癌患者中miR-15a呈低表達。進一步分析不同臨床病理指標患者miR-15a相對表達量發(fā)現(xiàn)，miR-15a相對表達量與子宮內膜癌患者的FIGO分期、淋巴結轉移、肌層浸潤程度、分化程度相關，隨著患者臨床分期、肌層浸潤程度、分化程度的增加以及出現(xiàn)淋巴結轉移，miR-15a相對表達量逐漸降低，表明miR-15a與子宮內膜癌患者的轉移、浸潤有一定關系，當miR-15a呈低表達時，可促進癌細胞的轉移或者浸潤。這與臨床相關研究結果[10,11]相近。為進一步分析在子宮內膜癌中miR-15a與癌細胞轉和侵襲的關系，本研究中通過體外細胞試驗的方法，對RL95-2細胞轉染不同的miR-15a模擬片段，采取Transwell腫瘤細胞侵襲試驗和Transwell腫瘤細胞遷移試驗對miR-15a不同表達細胞侵襲力、遷移力分別進行了測試。研究結果顯示，在轉染組中代表侵襲力、遷移力的穿膜細胞數(shù)計數(shù)均明顯高于未轉染組、對照組，表明miR-15a和子宮內膜癌細胞侵襲力、遷移力密切相關，高表達的miR-15a可能起到了抑制癌細胞侵襲、轉移的作用。

MMP-2為基質金屬蛋白酶家族的重要組成部分，當機體出現(xiàn)病理改變后MMP-9被相關因子激活，表達顯著上調，使得細胞外基質被大量降解，大大削弱了斑塊纖維帽，從而促進了冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展；同時，MMP-2能夠促使骨膠原出現(xiàn)降解，有助于加快瘤細胞的轉移或者侵襲、擴散等[12]。臨床相關研究指出，MMP-2在子宮內膜癌患者中呈高表達，而且與患者的組織浸潤、淋巴結轉移相關[13]。本研究結合MMP-2對過表達的miR-15a促進癌細胞轉移、侵襲的作用機制進行了分析，研究結果顯示，轉染組中MMP-2相對表達量要明顯低于未轉染組和對照組，提示miR-15a處于高表達時可能是通過對MMP-2表達進行抑制，從而發(fā)揮抑制子宮內膜癌細胞轉移、侵襲的作用。

綜上所述，在子宮內膜癌患者中miR-15a以低表達為主，且與淋巴結轉移、分化程度、肌層浸潤程度、FIGO分期有關，miR-15a作為抑癌基因可能是通過抑制MMP-2蛋白發(fā)揮抑制癌細胞轉移及侵襲的作用。

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Expression and clinical significance of miR-15a in endometrial carcinoma

SHAOTian.

GeneralHospitalofShandongProvincialYankuangGroup,ShandongZoucheng273500,China

Objective To investigate the expression and clinical significance of miR-15a in endometrial carcinoma tissues in order to explore the possible action mechanism of miR-15a in the pathogenesis and development of endometrial carcinoma.Methods The expression levels of of miR-15a were detected by fluorescence quantitative PCR in 68 cases of endometrial carcinoma tissues and 68 cases of adjacent tissues of tumor. The independent sequence analog (non-transfection group),miR-15a analog (transfection group) was transfected into RL95-2 endometrial cancer cells,respectively, moreover, an negative control group was established (control group). The expression levels of miR-15a and matrix metalloproteinase2 (MMP-2) were detected and compared among the three groups. Besides the invasion ability and migration ability of RL95-2 cells were detected by Transwell tumor cell invasion assay and Transwell tumor cell migration assay.Results The relative expression levels of miR-15a in endometrial carcinoma tissues were significantly lower than those in adjacent tissues of tumor (P<0.05). The relative expression levels of miR-15a were correlated to FIGO staging,lymph node metastasis, muscular layer infiltration degree and differentiation degree of endometrial carcinoma (P<0.05).TherelativeexpressionlevelsofmiR-15aintransfectiongroupweresignificantlyhigherthanthoseinnon-transfectiongroupandcontrolgroup,howevertherelativeexpressionlevelsofMMP-2intransfectiongroupweresignificantlylowerthanthoseinnon-transfectiongroupandcontrolgroup(P<0.05).BesidestheinvasionabilityandmigrationabilityofRL95-2cellsintransfectiongroupweresignificantlylowerthanthoseinnon-transfectiongroupandcontrolgroup(P<0.05).Conclusion The expression levels of miR-15a in patients with endometrial carcinoma are lower,moreover,which are correlated with lymph node metastasis,differentiation degree,myometrial invasion degree,FIGO staging. As a tumor suppressor gene, miR-15a may play an inhibitory role in the metastasis and invasion of cancer cells by inhibiting the expression of MMP-2 protein.

endometrial carcinoma；miR-15a；expression levels；metastasis and invasion；analysis

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.08.003

273500 山東省鄒城市，山東省兗礦集團總醫(yī)院

R

A

1002-7386(2017)08-1133-04

2016-10-19)