WT1在結腸癌中的表達及臨床意義

龔勇 仝巧云 鄭世華

·論著·

WT1在結腸癌中的表達及臨床意義

龔勇 仝巧云 鄭世華

目的 檢測WT1在結腸癌中的表達并探討其臨床意義。方法 應用免疫組化及半定量RT-PCR技術檢測WT1在48例結腸癌及14例正常結腸組織中的表達情況，分析其與結腸癌患者的臨床病理特征及預后等關系。結果 WT1在結腸癌中的陽性表達率明顯高于正常組織，差異有統計學意義(P<0.05)；WT1的表達與患者的年齡、性別和分化程度無關(P>0.05)；而與腫瘤的TNM分期、淋巴結轉移相關(P<0.05)；生存分析顯示WT1陽性表達組患者的生存期與陰性組差異無統計學意義(P>0.05)。結論WT1的高表達可能在結腸癌的發生發展中起重要作用，設想以WT1為靶點進行基因治療，有可能為結腸癌的治療提供新途徑。

WT1；結腸癌

結腸癌是消化道中常見的惡性腫瘤之一，多發生于40歲以上的男性患者，在我國發病率和病死率較高，由于結腸癌早期癥狀隱匿，易被忽視，多數患者確診時已至中晚期，預后較差，因此對于結腸癌的早期診斷及判斷預后有重要意義[1]。Wilms腫瘤基因(Wilms’ tumor gene,WT1)是最早發現的與Wilms腫瘤的發生發展有關的一類基因,其編碼的WT1蛋白通過識別、結合下游靶基因，產生激活或抑制等多種不同的生物學效應，在細胞的分化、增殖、凋亡、組織器官的發育及腫瘤的發生發展中起重要作用[2]。WT1在肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌等多種腫瘤細胞中異常表達，學者對WT1在白血病中的研究報道較多，但在結腸癌中的表達研究相對較少。我們采用免疫組化及RT-PCR等技術,檢測結腸癌及正常結腸組織中WT1的表達，分析其與結腸癌患者的臨床病理特征及預后等關系，為研究結腸癌發生的分子機制及預防治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2010年1月至2015年12月湖北省宜昌市中心人民醫院病理科存檔石蠟包埋的結腸標本62例：結腸癌組織48例,其中男30例，女18例；平均年齡(54.7±11.7)歲。正常結腸組織14例,其中男9例，女5例；平均年齡(57.5±13.1)歲。 患者術前均未行放化療,術后均有明確的病理學診斷。根據美國癌癥聯合委員會(AJCC)/國際抗癌聯盟(UICC)制定的結直腸癌TNM分期系統對48例結腸癌標本行TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期20例，Ⅲ～Ⅳ期28例； 組織學分級高中分化29例，低分化19例；有淋巴結轉移18例，無轉移30例。2組在性別、年齡分布差異無統計學意義(P>0.05)。WT1鼠抗人抗體、SP免疫組化染色試劑盒購于賽信通(上海)生物試劑有限公司；總RNA提取試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司，逆轉錄試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司；引物由NCBIprimer-BLAST軟件設計，由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1SP免疫組化:按試劑盒說明進行，WT1抗原采用酶消化修復，用PBS代替一抗作陰性對照，已知的陽性片作陽性對照。以細胞核內出現棕黃色顆粒定義為WT1陽性染色。每例隨機計數1 000個清晰的癌細胞,記錄陽性染色細胞數，以(陽性染色細胞數/1 000)×100%≥15%定為染色陽性，即過度表達。

1.2.2 總RNA的提取：①從之前保存在-80℃冰箱中取出組織塊重量約100mg，放在EP管中后研磨至勻漿狀，加入1mlTlrizol試劑，室溫靜置5min； ②加入200μl氯仿 ，振蕩15s，室溫靜置5min，離心(4℃、12 000r/min、15min)；③吸取上層液體，加入500μl異丙醇，混勻后室溫靜10min，離心(4℃、12 000r/min、15min)； ④棄上清，加入1ml75%乙醇，離心(4℃、7 500r/min、15min)棄上清；⑤加入RNasefreewater溶解RNA沉淀。

1.2.3cDNA合成：取2μl已提取的RNA，加入到98μl經 0.1%DEPC滅活RNA酶的去離子水中，用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA。

1.2.4RT-PCR引物及擴增反應：引物由Invitrogen公司合成:WT1上游引物：5’-GGCATCTGAGACCAGTGAGAA-3’、下游引物：5’-GAGAGTCAGACTTGAAAGCAGT-3；β-actin內參上游引物5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’；下泳引物：5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。擴增取cDNA1μl依次加入10×緩沖液、4種dNTP、20pmol的WT1引物(β-actin引物為10pmol)、Taq聚合酶2U、25mmol/LMgCl28μl。擴增條件：94℃變性1min、64℃退火1min、72℃延伸2min、共40個循環。

1.2.5PCR產物的分析：取PCR產物5μl，在2%瓊脂糖凝膠電泳(含0.5μg/ml溴化乙錠)，經凝膠圖像分析儀對電泳條帶亮度分析拍照，采用成像分析系統處理。以β-actin作為內參照，計算WT1mRNA的相對表達量。

2 結果

2.1 結腸癌及正常結腸組織中WT1的表達 在臨床和病理雙盲的情況下，由2名有經驗的病理科醫師對所有切片在顯微鏡下觀察WT1的染色結果，WT1的陽性表達表現為腫瘤細胞核呈棕黃色染色。WT1在結腸癌組織中的表達率為87.50%(42/48)，明顯高于其在正常結腸組織中的表達率21.43%(3/14)，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 結腸癌組織WT1蛋白的表達與臨床病理參數關系WT1的表達與患者年齡、性別、腫瘤部位無關(P>0.05)；WT1在TNM分期Ⅰ-Ⅱ期和Ⅲ-Ⅳ期的陽性表達率分別為70.00%、100.00%；在高中分化組、低分化組的陽性表達率分別為72.22%、96.67%，WT1的表達隨腫瘤分期而升高、細胞分化降低而升高,2組比較有統計學差異(P<0.05)。見表1。

表1 WT1的表達及與結腸癌臨床病理參數的關系

2.3WT1mRNA在結腸癌組織中的表達情況WT1基因和β-actin內參基因共同擴增，對RT-PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，可以看出WT1基因mRNA條帶亮度及產量明顯高于正常結腸組織，分析儀分析電泳條帶亮度并進行灰度值結果顯示WT1mRNA在結腸癌組織中的相對表達量為(2.08±0.44)，與正常組織的相對表達量(0.23±0.37)相較，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1。

圖1 第1泳道：空白對照；第2泳道：癌旁組織；第3、4、5泳道：癌組織

2.4WT1蛋白表達與患者術后生存期分析 對48例結腸癌患者術隨訪，6例WT1蛋白表達陰性的結腸癌患者術后 4年累積生存率為70.12%，中位生存期38個月；42例WT1蛋白表達陽性的患者術后4年累積生存率為41.02%，中位生存期24個月，2組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 WT1蛋白陰、陽性表達的患者術后生存曲線

3 討論

Wilms腫瘤基因是MaxWilm等于1989年從兒童腎母細胞瘤(Wilm's瘤)染色體11p13分離出來的腫瘤基因，含有10個外顯子，轉錄mRNA產物長約3kb[3]。WT1基因有多種不同的RNA剪切方式，其編碼的蛋白為一多功能調控調節因子，主要功能是識別、結合某些生長因子基因的啟動子來調節轉錄,如血管內皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子Ⅱ(IGF2)、集落刺激因子Ⅰ(CSF-Ⅰ)、癌基因Bcl2、抑癌基因P53、NDRG2等[4-6]。因此WT1在調節細胞的增殖、生長、分化、凋亡以及腫瘤細胞的發生發展中起重要的作用[7]。

國內外學者對WT1進行深入研究，WT1在白血病細胞、胰腺癌、肺癌、和甲狀腺癌等惡性腫瘤細胞中高度表達[8,9]。近來研究發現WT1的表達與結腸癌的發生發展關系密切，國外學者Koesters等[10]應用RT-PCR及Westernblot檢測分析了一系列人結腸癌細胞株WT1mRNA及其編碼蛋白的表達情況，并通過序列分析確定WT1基因鋅指結構區突變部位，結果結果示WT1mRNA在SW707、SW480 、SW948三類細胞株中高表達；在Colo320、KM12、LS180、Lovo、CX1、HT29、HCT116 等七類細胞株中也存在較高表達，而在LS174T和SW48兩類細胞株及來自人正常結腸黏膜細胞中不表達；同時對15例原發性結腸癌組織中WT1mRNA水平進行檢測，結果陽性表達率達86.68%(13/15),而在正常結腸黏膜組織中WT1mRNA的表達卻很低。使用人類白細胞抗原肽對WT1特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)誘導活化，活化的CTLs不僅溶解外源性同源肽，也抑制了結腸腫瘤細胞WT1的表達。這些研究結果證實了WT1基因表達產物的高表達對結腸癌的發生發展起重要作用。

為探討WT1在結腸癌組織中的表達及與臨床病理參數關系,我們采用免疫組織化學及RT-PCR分別檢測了WT1在48例結腸癌及14例正常結腸組織中的表達：WT1在結腸癌組織中的表達率為87.50%(42/48),明顯高于正常組織21.43%(3/14)，2組比較差異有統計學意義(P<0.05)，這一研究結果初步提示：結腸癌組織中WT1的高表達可能參與了結腸癌的發生。我們進一步探討WT1與結腸癌臨床病理聯系:WT1有隨腫瘤分期升高、細胞分化降低而升高的趨勢，但WT1蛋白表達的高低與結腸癌患者術后生存期無明顯關系,綜合分析認為WT1的高表達與結腸癌的惡性程度、侵襲和轉移密切相關，但與預后關系不明,提示WT1的過度表達可能與結腸腫瘤的惡性程度有關，WT1是否可以作為指標來反映結腸癌的臨床病理特征及預后,有待于進一步收集隨訪資料來研究證實。

作為一個特異性轉錄調控因子，WTl在多種腫瘤中異常表達。雖然我們的實驗表明WTl在結腸癌中發揮著癌基因的作用，參與了結腸癌的發生、發展、浸潤和轉移，但WTl的具體生物學行為以及作用機制尚未完全清楚，需我們進一步研究。WTl的多種生物學功能表明WTl是一個非常有前景的腫瘤治療靶點，設想以WT1基因為靶點進行基因治療，抑制WT1基因轉錄活性，降低WT1的表達，促進細胞凋亡，有可能為結腸癌的治療開辟新途徑。

1SiegelR，NaishadhamD，JemalA.Cancerstatistics,2013.CA:ACancerJournalforClinicians,2013,63:11-30.

2MartínezCH,DaveS,IzawaJ.Wilms’gene.AdvExpMedBiol,2010,685:196-209.

3CallKM，GlaserT，ItoCY,etal.Isolationandcharacterizationofazincfingerpolypeptidegeneatthehumanchromosome11Wilms’tumorlocus.Cell,1990,60:509-520.

4HarutaM,AraiY,SugawaraW.DuplicationofpaternalIGF2orlossofmaternalIGF2imprintingoccursinhalfofWilmstumorswithvariousstructuralWT1abnormalities.GenesChromosomesCancer,2008,47:712-727.

5FurusatoE,HidayatAA,ManYG,etal.WT1andBcl2expressioninmelanocyticlesionsoftheconjunctiva:animmunohistochemicalstudyof123cases.ArchOphthalmol,2009,127:964-969.

6DupontJ,WangX,MarshallDS,etal.WilmsTumorGene(WT1)andp53expressioninendometrialcarcinomas:astudyof130casesusingatissuemicroarray.GynecolOncol2004,94:449-455.

7ZirnB,HartmannO,GesslerM.ExpressionprofilingofWilmstumorsrevealsnewcandidategenesfordifferentclinicalparameters.Cancer,2006,118:1954-1962.

8 龔勇，趙秋,楊芳，等.胰腺導管腺癌組織中WT1,IGF-IR表達與細胞凋亡的關系.世界華人消化雜志,2006,14:2810-2814.

9 蒙秋，吳清萍，黃守國.WT1基因在子宮頸癌組織細胞中的表達及意義.疑難病雜志,2013，12:614-616.

10KoestersR,LinnebacherM,CoyJF,etal.WT1isatumor-associatedantigenincoloncancerthatcanberecognizedbyinvitrostimulatedcytotoxicTcells.Cancer,2004,109:385-392.

Expression and clinical significance of WT1 in colon cancer

GONGYong,TONGQiaoyun,ZHENGShihua.

DigestiveDiseaseResearchInstituteofSanxiaUniversity,DepartmentofGastroenterology,CentralPeople’sHospitalofYichangCity,Hubei,Yichang443003,China

Objective To observe the expression of WT1 in colon carcinoma, and to explore its clinical significance.Methods The expression levels of WT1 in 48 cases of colon carcinoma and 14 cases of normal colon tissues were detected by immunohistochemistry and semi quantitative RT-PCR.The correlation between the expression of WT1 and clinical pathological features as well as patient's prognosis was analyzed.Results The positive expression rates of WT1 in colon carcinoma were significantly higher than those in normal colon tissues (P<0.05).TheexpressionofWT1wasnotcorrelatedtopatient'sageandsex,differentiationdegreeoftumor(P>0.05),however,whichwasrelatedwithTNMstagingandlymphnodemetastasisoftumor(P<0.05).ThesurvivalanalysisshowedthattherewasnosignificantdifferenceinsurvivaltimebetweenpatientswithWT1positiveexpressionandpatientswithWT1negativeexpression(P>0.05).Conclusion The high expression of WT1 may play an important role in the pathogenesis and development of colon cancer,which may provide an new way for treatment of colon cancer.

WT1; colon cancer

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.08.015

443003 三峽大學消化病研究所 湖北省宜昌市中心人民醫院消化內科

R

A

1002-7386(2017)08-1176-03

2016-09-20)