不同黃芪用量補陽還五湯對糖尿病大鼠周圍神經(jīng)修復再生的影響*

河北中醫(yī)學院中西醫(yī)結合學院

賁 瑩 張鳳華 張 冬 方 倩 杜澍金(石家莊 050091)

方 藥 研 究

不同黃芪用量補陽還五湯對糖尿病大鼠周圍神經(jīng)修復再生的影響*

河北中醫(yī)學院中西醫(yī)結合學院

賁 瑩 張鳳華 張 冬 方 倩 杜澍金(石家莊 050091)

目的：探討不同黃芪用量補陽還五湯對糖尿病大鼠周圍神經(jīng)再生修復的影響。方法：用鏈脲佐菌素 (STZ) 誘導建立 SD 大鼠糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)模型，并隨機分為模型組、60 g黃芪組、120 g黃芪組和彌可保組。60 g黃芪組和120 g黃芪組分別用含對應量黃芪的補陽還五湯濃度煎劑灌胃，彌可保組用175 μg/kg·d-1彌可保灌胃，另設正常對照組。給藥 12 周后，檢測空腹血糖 ( FBG) 、坐骨神經(jīng)傳導速度、血液流變學變化、神經(jīng)生長因子mRNA(NGF mRNA)表達水平和坐骨神經(jīng)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 (caspase-3) 活性。結果：與模型組比較，120 g黃芪組坐骨神經(jīng)傳導速度、NGF mRNA表達明顯上升，高、中、低切全血黏度、血漿黏度及caspase-3 活性明顯下降(P<0.05，P<0.01)；60g黃芪組感覺神經(jīng)傳導速度、NGFmRNA表達上升，低切全血黏度、血漿黏度下降 (P<0.05) 。結論：補陽還五湯能促進神經(jīng)修復、再生，減少神經(jīng)細胞凋亡，提高坐骨神經(jīng)傳導速度，對DPN有治療作用。其中120g黃芪用量的補陽還五湯療效更好。

糖尿病周圍神經(jīng)病變; 補陽還五湯; 黃芪；不同劑量；消渴；痹證；補氣活血通絡

糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN) 是臨床糖尿病患者常見的并發(fā)癥之一，經(jīng)神經(jīng)功能檢查證明60%～90%的糖尿病患者均出現(xiàn)不同程度的周圍神經(jīng)病變，[1]其發(fā)病機制為多因素復合致病：神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏、微血管病變、代謝紊亂、氧化應激損傷等。致病因素雖多，最終的結果卻都是造成周圍神經(jīng)變性、壞死，修復、再生障礙。

傳統(tǒng)中醫(yī)理論認為消渴日久，脾失健運，氣虛不能行血，使瘀血阻于絡脈，氣血不能灌滲濡養(yǎng)而發(fā)為本病。[2]筆者在臨床中對DPN患者采用補陽還五湯加減治療，取得了較好療效。補陽還五湯見于清·王清任所著《醫(yī)林改錯》，該方特點是大劑量應用黃芪為君藥，書中寫到 “黃芪用一二兩，以后漸加至四兩”。并配以活血藥物，起到補氣活血通絡的作用。

本實驗擬檢測不同黃芪用量補陽還五湯對糖尿病大鼠血液流變學、周圍神經(jīng)傳導速度、周圍神經(jīng)凋亡及再生修復的影響，探究補陽還五湯對糖尿病周圍神經(jīng)病變的治療作用及機制，明確黃芪的最佳用量，以期指導臨床用藥。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:雄性體質量為180～220gSD大鼠50只，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供(動物合格證號1301053)。

1.1.2 藥物:補陽還五湯根據(jù)《醫(yī)林改錯》所載，設為2種組方：一種為黃芪60g，當歸6g，赤芍、川芎各4.5g，桃仁、紅花、地龍各3g；另一種為黃芪120g，其余藥物用量不變。以上2種組方藥物分別持續(xù)浸泡2h，水煎2次，40min/次，將2次藥液混合、進一步濃縮，所得2組濃縮液各含生藥1.36g/mL、2.4g/mL。彌可保由衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 試劑：鏈脲佐菌素(STZ)購于Sigma公司；大鼠半胱天冬酶3(Caspase-3)Elisa試劑盒購于BG公司；逆轉錄試劑盒購自上海生物有限公司，引物由上海生物有限公司合成。

1.1.4 儀器：肌電圖誘發(fā)電位儀(DANTECCantata)；全自動血液流變儀(型號LBY-N7500B，北京普利生儀器有限公司)；OnetouchII型血糖儀(美國強生公司)，北京普利生儀器有限公司；擴增儀(ThermoPx2)；凝膠成像系統(tǒng)(GelLoglc100)。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模：將實驗動物隨機分為5組，正常對照組、模型組、60g黃芪組、120g黃芪組、彌可保組，每組10只。12h禁食后，除正常組外，其余各組大鼠給予鏈脲佐菌素(60mg/kg)一次性腹腔注射。對照組大鼠給予等量的檸檬酸緩沖液腹腔注射。糖尿病大鼠模型確立標準：72h后大鼠禁食8h，測尾靜脈血糖≥16.7mmol/L。

1.2.2 藥物干預：造模成功后，60g黃芪組、120g黃芪組立即開始每天給予相應黃芪劑量濃縮藥液，按10mL/kg灌胃；彌可保組立即開始每天給予彌可保175μg/kg灌胃；等體積的蒸餾水給予對照組和模型組。藥物干預持續(xù)12周，干預期間給予自由飲食。

1.2.3 指標檢測：除空腹血糖外，其余檢測項目均在藥物干預結束后進行。

1.2.3.1 周圍神經(jīng)傳導速度檢測：以水合氯醛(僅作用于中樞神經(jīng)，對周圍神經(jīng)無影響)麻醉實驗大鼠，檢測右側坐骨神經(jīng)傳導速度。第一刺激部位為坐骨窩，第二刺激部位為踝部。均經(jīng)皮插入間距為 2mm的2個針電極。 (1)感覺神經(jīng)傳導速度(SCV):H反射用方形波在坐骨窩和踝部刺激激發(fā)，分別記錄反射潛伏期。計算兩刺激部位的潛伏期差值，并測量坐骨窩和踝部間的距離。距離/潛伏期差值即為SCV。 (2)運動神經(jīng)傳導速度(MCV):在同側足部骨間肌放置2個針電極。以方形波刺激，記錄M波潛伏期，求得兩刺激部位的潛伏期差值。測量坐骨窩和踝部間的距離。距離/潛伏期差值即為MCV。

1.2.3.2 血液相關指標檢測：分別于4、8、12周進行尾靜脈采血檢測空腹血糖(FBG)。藥物干預結束后，腹主動脈采血，全自動血液流變儀測定血液流變學指標。

1.2.3.3 坐骨神經(jīng)NGFmRNA測定：取坐骨神經(jīng)并置液氮中保存，Trizol一步法提取坐骨神經(jīng)總RNA。應用逆轉錄聚合式酶聯(lián)反應技術(RT-PCR)檢測NGFmRNA表達。引物序列：5'-CGGCTTTGGTGACTGGATAG-3'，5'-TGAGGACCAGAGCAGACAGG-3'，125bp。GAPDH為內(nèi)參，引物序列：5'-ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3'，5'-GTTTCTTACTCCTTGGAGG-3'，200bp。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后成像，用凝膠成像分析系統(tǒng)對各電泳條帶平均光密度值分析，以NGF/GAPDH的比值半定量反映NGFmRNA在坐骨神經(jīng)中的表達水平。

1.2.3.4 坐骨神經(jīng)caspase-3檢測：給藥結束后，取雙側坐骨神經(jīng)。生理鹽水預冷，清洗去除坐骨神經(jīng)上的雜質，殘留水分用濾紙吸干，坐骨神經(jīng)置于液氮中凍存，待測Caspase-3。ELISA法測定坐骨神經(jīng)Caspase-3，操作依據(jù)試劑盒說明進行。

2 結果

2.1 不同時間段FBG檢測結果 模型組及3組藥物干預組FBG均較對照組顯著增高。組間比較差異無顯著性。詳見表1。

2.2 坐骨神經(jīng)傳導速度變化 模型組坐骨神經(jīng)MCV和SCV較對照組顯著減慢(P<0.01)；120g黃芪組和彌可保組MCV較模型組增高(P<0.05)；3藥物干預組SCV較模型組提高，其中120g黃芪組提高更顯著(P<0.01)。詳見表1。

組別FBG(mmol/L)4周 8周 12周MCV(m/s)SCV(m/s) 對照組4.96±0.635.02±0.584.87±0.5145.26±4.3546.45±7.12模型組26.54±3.77△25.83±4.14△26.10±3.81△30.17±5.16△29.21±9.38△60g黃芪組27.21±3.2626.36±3.5225.97±2.7234.82±6.3637.06±6.74*120g黃芪組26.25±3.8925.74±3.1624.16±3.0537.36±6.22*40.17±5.25**彌可保組27.12±4.7627.03±3.8526.68±3.7236.30±7.12*38.14±6.86*

注：與對照組比較，△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.3 血液流變學變化 模型組較對照組低切、中切、高切全血黏度及血漿黏度顯著升高(P﹤0.01)。與模型組比較，60g黃芪組可顯著降低低切全血黏度和血漿黏度(P﹤0.05)，120g黃芪組可顯著降低低切、中切、高切全血黏度及血漿黏度(P﹤0.05)。詳見表2。

2.4 坐骨神經(jīng)NGFmRNA表達和caspase-3 活性的變化 與對照組比較，模型組坐骨神經(jīng)NGFmRNA表達明顯降低，而caspase-3 活性明顯升高，(P<0.01)。與模型組比較，60g黃芪組、120g黃芪組和彌可保組NGFmRNA表達均明顯增高(P<0.05，P<0.01)。120g黃芪組和彌可保組caspase-3活性較模型組降低(P<0. 01，P<0.05)。詳見表2。

組別全血黏度(mPa·s)低切中切高切血漿黏度(mPa·s)Caspase-3(ng/mL)NGFmRNA相對表達量對照組9.36±1.795.68±1.534.52±1.121.41±0.2618.17±2.510.94±0.03模型組14.35±4.18△8.37±1.14△7.51±1.84△2.15±0.42△31.74±4.92△0.50±0.09△60g黃芪組11.42±3.46*7.07±1.636.01±1.721.71±0.45*28.33±3.820.68±0.07*120g黃芪組10.87±4.09*6.91±1.54*5.32±1.752*1.69±0.47*25.45±3.67**0.73±0.10**彌可保組12.12±4.767.03±3.856.68±3.721.83±0.5326.04±3.73*0.74±0.09**

注：與對照組比較，△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

DPN確切發(fā)病機制尚不完全清楚, 是多因素共同作用的結果，其中血液流變學改變造成的微循環(huán)障礙及NGF水平的降低是其中的2個重要因素。血流變學改變致使神經(jīng)微血管灌注減少，神經(jīng)缺血、缺氧，進而發(fā)生變性壞死。NGF可由軸突逆向運輸，有營養(yǎng)神經(jīng)元，支持神經(jīng)結構，保護受損神經(jīng)元，促進損傷后的修復再生的作用。[3-4]DPN時，NGF減少且延軸突逆行運輸能力下降，繼而使周圍神經(jīng)修復再生能力下降。[5]有研究表明，DPN大鼠坐骨神經(jīng)中NGFmRNA表達水平明顯降低，其降低程度與病情輕重呈正比。[6-7]本實驗中，模型組血黏稠度升高，NGFmRNA表達下降，促使神經(jīng)細胞凋亡，符合相關報道。[6-7]從中醫(yī)角度看，血黏稠度增高是血瘀證表現(xiàn),[8]NGFmRNA表達下降可辨為正氣虛。氣為血之帥，氣虛則血瘀，正虛邪實，發(fā)而為病。在臨床中，筆者發(fā)現(xiàn)多數(shù)DPN患者辨證為氣虛血瘀證，與上面的分析相一致。根據(jù)實驗結果，補陽還五湯能提高坐骨神經(jīng)傳導速度(神經(jīng)傳導速度下降是診斷DPN的金標準)，降低血黏稠度，使NGFmRNA表達升高，降低caspase-3 活性。說明補陽還五湯能從血液流變學和NGF兩個方面發(fā)揮作用，改善糖尿病大鼠的周圍神經(jīng)血供，促進神經(jīng)修復、再生，減少神經(jīng)細胞凋亡。

補陽還五湯是清·王清任所創(chuàng)補氣活血通絡方劑。該方重用黃芪，大補元氣，令氣旺血行，瘀去絡通，其用量遠遠大于其他活血藥物，為君藥。原書中寫到“黃芪用一二兩，以后漸加至四兩”，用量之大在其它方劑中較為少見。這樣組方可使氣旺血行，活血而不傷正，為氣虛血瘀理論的代表性方劑。目前，以補陽還五湯化裁治療DPN報道有50余篇，結果均表明其有確切療效，但這些報道的黃芪用量多在30～60g之間，[9-10]本實驗顯示120g黃芪用量的補陽還五湯治療效果優(yōu)于60g黃芪用量的補陽還五湯。此結果進一步印證了“氣虛則血瘀，氣旺則血行”的中醫(yī)基礎理論。故應用補陽還五湯治療DPN時，建議王清任原方120g黃芪用量，其療效更佳。

由于DPN為多因素致病，本實驗僅從血液流變學和NGF兩個方面進行了探討，補陽還五湯是否還從其它靶點發(fā)揮效用，尚需進一步深入研究。

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(2017-01-06 收稿)

*河北省教育廳科研青年基金項目：No.QN2014019

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