利用微電極技術研究厭氧顆粒污泥內部的微環境

李 清， 劉 芳， 張 哲， 王 慧， 楊樹成

(西安交通大學 能源與動力工程學院， 西安 710049)

利用微電極技術研究厭氧顆粒污泥內部的微環境

李 清， 劉 芳， 張 哲， 王 慧， 楊樹成

(西安交通大學 能源與動力工程學院， 西安 710049)

文章分別以蔗糖、乙酸和丁酸為進水唯一碳源，運行3個UASB反應器，當反應器穩定運行后，采用自制氫離子選擇性液膜微電極對3種厭氧顆粒污泥進行內部pH值梯度分析，并對厭氧顆粒污泥進行了多種測試底物的產甲烷活性分析和16S rDNA測序分析。結果表明，采用微電極技術可以準確測定厭氧顆粒污泥內部的pH值梯度，并推斷微生物種群的空間分布，所得結果與產甲烷活性和16S rDNA測序分析結果相一致，說明微電極技術可作為厭氧顆粒污泥內部微環境分析和微生物種群空間分布研究的有力工具。

厭氧顆粒污泥； 微電極； 微環境； 產甲烷活性

厭氧顆粒污泥實質上是多種微生物的聚集體，水解發酵菌、產氫產乙酸菌、同型產乙酸菌以及產甲烷菌組成了一個互營共生的微生態系統[1]。在厭氧顆粒污泥中，厭氧微生物生態系統不斷演化的過程[2]受多種因素的影響，如廢水性質、污泥負荷率、系統的選擇壓、pH值和溫度等。不同的環境條件所培養出的污泥的微生物種群結構和空間分布不同，所以有機物降解途徑不同，表現為各個厭氧顆粒污泥的微環境差異。

厭氧顆粒污泥微環境的研究對于揭示厭氧顆粒污泥形成和結構具有重要意義，基于分子生物學方法的PCR和熒光原位雜交(FISH)等技術常用于微生物群落和空間分布的分析，但這些技術難以提供微生物在聚集體中的原位活性信息。而微電極恰可以彌補不足，微電極技術是20世紀七八十年代興起的一種分析手段[3]，其尖端可低至1 μm以下，因此具有很高的空間分辨率，是測定極小體積(微米范圍)對象的微小濃度變化的特殊工具。微電極能夠原位監測顆粒污泥內部底物、中間和最終產物濃度的空間變化，進而確定微生物活性和不同種群微生物的空間分布情況[4]。

筆者針對蔗糖、丁酸、乙酸為進水底物培養的厭氧顆粒污泥，基于不同有機物厭氧降解途徑差異引起顆粒污泥內部pH值的變化，用實驗室自制的pH值離子選擇性液膜微電極對3種厭氧顆粒污泥的微結構進行研究，并對3種污泥進行16S rDNA測序分析其種群結構，同時測試污泥的產甲烷活性，以揭示顆粒污泥的形成、結構與進水組成的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗裝置

實驗采用3個有機玻璃制成UASB反應器，內徑D為80 mm，三相分離器以下高h為520 mm，有效容積約3 L。反應器進水管管口向下，廢水泵入后經反應器底部的反射作用，能較均勻的與反應區污泥相混合，避免短流和溝流現象。反應器整體置于恒溫室內，將水溫控制在30℃±1℃。

1.2 接種污泥及進水水質

接種污泥為咸陽市某造紙廠的IC反應器底部顆粒污泥，污泥VS/TS=70.9%，3個反應器接種相同量的污泥，反應器內污泥初始濃度為12.3 gVSS·L-1。

UASB反應器進水采用自配的合成廢水，1號，2號和3號反應器(以下依次稱為R1，R2和R3)分別以蔗糖、乙酸和丁酸為單一碳源，穩定運行后其濃度均為3 gCOD·L-1。R1用NaHCO3調節堿度，其濃度為3 g·L-1，R2和R3的酸均用NaOH中和，控制進水pH值不低于6.5；此外，3個反應器的進水中均投加等量的營養物質、微量元素和酵母粉[1]。

1.3 微電極測試系統

UASB穩定運行后，取污泥樣品于微型模擬反應槽(見圖1)，其進水水質模擬反應器條件，通過向微型槽吹氮氣保持污泥的厭氧環境，用pH微電極測量污泥并采集數據。整個測試系統如圖1所示。

圖1 pH 微電極測量系統

1.3 分析方法

1.3.1 微電極的制作

pH微電極制備程序主要包括玻璃毛細管拉制、硅烷化、液態離子選擇性膜和膜后電解液的填充[5]。制備出的pH微電極性能如下：Nernst斜率在20℃時為-57 mV·pH-1，25℃時為-59 mV·pH-1，符合Nernst方程；響應時間在60 s之內；壽命在20 d左右；線性范圍為pH值4～11，可滿足微生物體系pH值測量的需求。

1.3.2 測定方法

COD采用重鉻酸鉀回流法[6]測定；顆粒污泥VS/TS采用重量法[1]；pH值采用pH計測定；污泥的最大比產甲烷活性采用全自動甲烷潛力測試系統AMPTSⅡ(瑞典bioprocessControl公司)測定；微生物種群多樣性采用宏基因組及16S rDNA測序分析。

2 實驗結果與討論

2.1 UASB反應器性能

控制UASB反應器的水力停留時間為8 h，以進水濃度為1 gCOD·L-1的條件啟動反應器，根據COD去除率和VFA濃度，逐步提高進水濃度，啟動20 d時進水濃度達3 gCOD·L-1，負荷提升至9 kgCOD·m-3d-1，認為啟動階段結束。后續維持該負荷持續運行反應器，其中反應器啟動和穩定運行前30 d的數據如圖2所示。可以看出，在啟動15 d后，R1，R2，R3反應器的COD去除率一直都在90%以上，說明反應器運行良好。

圖2 UASB反應器COD去除率變化

2.2 厭氧顆粒污泥的微電極分析

UASB反應器穩定運行60 d以上后，從3個反應器中取出厭氧顆粒污泥進行微電極分析。

2.2.1 R1反應器(底物蔗糖)中污泥pH微電極分析

取R1反應器中厭氧顆粒污泥，以蔗糖為底物，在微型反應槽內用pH微電極測試厭氧顆粒污泥內部不同位置pH值變化，結果如圖3所示。

由圖3可以看出，從顆粒污泥表層到污泥內部200 μm處時pH值逐漸降低至最低，這可能是因為在此區域發生水解酸化和產氫產乙酸過程，蔗糖轉

圖3 R1反應器(底物蔗糖)中顆粒污泥內部pH值梯度

化為單糖，VFA，CO2，H2后，進一步轉化為乙酸和氫氣。在200 μm～700 μm處pH值逐漸上升達到最大值7.5，說明在此區域發生產甲烷過程，污泥外層產生的乙酸逐步被消耗，轉化為更弱的酸CO2，從而引起pH值升高。由此可以推斷在成熟的厭氧顆粒污泥中，水解酸化發酵菌和產氫產乙酸菌主要存在于顆粒最外層以及中間層，對于測試污泥樣品來說，200 μm處大致為是產甲烷菌的分界處，產甲烷菌在顆粒污泥核心為優勢菌群。

2.2.2 R2反應器(底物乙酸)中污泥pH微電極分析

取R2反應器中厭氧顆粒污泥，分別以蔗糖、乙酸為底物，測試厭氧顆粒污泥內部不同位置pH值變化，結果分別如圖4所示。

圖4 R2反應器(底物乙酸)中顆粒污泥采用不同測試底物時內部pH值梯度

由圖4可以看出，測試底物為乙酸時，厭氧顆粒污泥內部pH值呈逐漸上升趨勢，在核心500～800 μm處，pH值基本不變，這是由于擴散進入的乙酸被產甲烷菌轉化為甲烷和二氧化碳，乙酸濃度逐漸降低，到污泥核心時乙酸基本被完全降解，pH值達到最高。

由圖4可以看出，當以蔗糖和丁酸為測試底物時，厭氧顆粒污泥內部pH值變化很小，說明蔗糖和丁酸在顆粒污泥內部沒有發生產甲烷過程。

由上述結果可推斷，乙酸廢水培養的厭氧顆粒污泥微生物群落相對簡單，主要為降解乙酸的產甲烷菌，降解蔗糖和丁酸的微生物相對較少。

2.2.3 R3反應器(丁酸底物)中污泥pH微電極分析

取R3反應器中厭氧顆粒污泥，分別以乙酸、丁酸為底物，用pH微電極測試厭氧顆粒污泥內部不同位置pH值變化，結果分別如圖5所示。

圖5 R3反應器(底物丁酸)中顆粒污泥采用不同測試底物時內部pH值梯度

當測試底物為丁酸時，與主體溶液相比，污泥表面pH值略有降低，可能與丁酸的產氫產乙酸過程有關；在污泥內部pH值逐漸升高，可能是丁酸降解產生的乙酸被產甲烷菌轉化為甲烷和CO2；pH值在污泥中間位置達到穩定，說明丁酸和產生的乙酸在中間完成了降解。

當測試底物為乙酸時，曲線與測試底物為丁酸時類似，污泥內部pH值逐步上升并趨于穩定，說明乙酸被產甲烷菌利用。

當測試底物為蔗糖時，厭氧顆粒污泥內部pH值變化很小，說明蔗糖在顆粒污泥內部沒有發生酸化和產甲烷過程。

由此推斷，丁酸廢水培養的厭氧顆粒污泥具有產氫產乙酸菌和產甲烷菌等菌群，產甲烷菌分布在污泥中間位置，但能夠將蔗糖水解發酵的微生物種群含量較少。

2.3 厭氧顆粒污泥種群結構分析

2.3.1 不同測試底物條件下污泥產甲烷活性評價

對于3個不同進水的UASB反應器中的顆粒污泥，分別以蔗糖、乙酸和丁酸作為測試底物，進行污泥產甲烷活性測試，測得結果如圖6～圖8和表1所示。根據圖6和表1結果，對于反應器R1中蔗糖為底物培養的污泥，采用蔗糖、乙酸和丁酸作為產甲烷活性測試底物，其產甲烷積累量相近，對于產甲烷菌可以直接利用的乙酸，其最大產甲烷速率和產甲烷活性均稍大；根據圖7和表1結果，對于反應器R2中乙酸為底物培養的污泥，以乙酸作為測試底物時產甲烷積累量最多，產甲烷活性最大，以丁酸和蔗糖作為測試底物時，產甲烷活性急劇下降，說明該污泥中降解蔗糖和丁酸的微生物種群含量較少；根據圖8和表1結果，對于反應器R3中丁酸為底物培養的污泥，測試底物乙酸和丁酸產甲烷積累量和產甲烷活性均較為接近，而測試底物為蔗糖時，產甲烷活性大幅降低，說明該污泥中降解蔗糖的微生物種群含量較少。

圖6 不同測試底物條件下R1反應器(底物蔗糖)中顆粒污泥的CH4積累量

因此，雖然3個UASB反應器接種同一來源的污泥，采用不同進水馴化培養，并達到穩定后，微生物種群發生了很大變化。對于反應器R1中蔗糖培養的顆粒污泥來說，其顆粒污泥種群豐富，具備水解酸化、產氫產乙酸、產甲烷種群，底物越簡單越有利于底物的降解，乙酸可以不經過水解酸化、產氫產乙酸階段，可直接由產甲烷菌降解產甲烷，擴散為其限制條件。反應器R2中乙酸培養的成熟顆粒污泥主要是由嗜乙酸產甲烷菌組成，對非乙酸底物，降解受限。反應器R3中丁酸培養的成熟顆粒污泥主要為乙酸和丁酸降解的主要菌群，缺乏發酵細菌，因此蔗糖降解的水解酸化為其限制條件。

圖7 不同測試底物條件下R2反應器(底物乙酸)中顆粒污泥的CH4積累量

圖8 不同測試底物條件下R3反應器(底物丁酸)中顆粒污泥的CH4積累量

測試底物R1污泥(底物蔗糖)R2污泥(底物乙酸)R3污泥(底物丁酸)蔗糖乙酸丁酸蔗糖乙酸丁酸蔗糖乙酸丁酸產甲烷速率/(mLCH4·h-1)14.5115.6615.563.7315.031.464.1418.6919.78產甲烷活性/(gCODCH4·gVSS-1d-1)0.440.500.470.120.490.050.140.660.68

注：取5～20 h為最大活性區間計算產甲烷活性

2.3.2 16S rDNA測序分析

利用高通量測序技術對3個UASB反應器中顆粒污泥中的細菌和古菌分別進行16S rDNA測序，分析菌群多樣性。圖9是3種污泥中細菌在門水平上的出現概率，可以看出，優勢細菌主要為綠彎菌門(Chloroflexi)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Protecbacteria)，他們主要是水解酸化、產氫產乙酸的功能菌群[7]，根據細菌種群的豐富程度，R1(蔗糖為底物)>R3(丁酸為底物)>R2(乙酸為底物)，這說明經過馴化培養后，在較為簡單的丁酸和乙酸培養環境中，難以適應的很多細菌種群逐漸被淘汰，細菌種群越來越單一。

圖9 不同底物培養的厭氧顆粒污泥中細菌分布圖

根據高通量測序的古菌的多樣性分析結果，基于97%的相似水平，蔗糖底物、乙酸底物、丁酸底物培養的顆粒污泥中序列數分別被分為991OUTs，855OUTs，933OUTs，與底物的易被降解程度呈正相關；同時，樣本覆蓋率對應上上述底物依次為0.98，0.99，0.98，水平較高，說明所測序列幾乎全部檢出。蔗糖底物、乙酸底物、丁酸底物培養的顆粒污泥Simpson指數分別為0.42，0.63，0.33，這表示乙酸培養的顆粒污泥的古菌種群多樣性水平最低，蔗糖培養的顆粒污泥的古菌種群多樣性水平最高。根據圖10，3個反應器的厭氧顆粒污泥，其古菌種類區別明顯，反應器R1中蔗糖培養的厭氧顆粒污泥古菌菌群較為豐富；反應器R2中乙酸培養的厭氧顆粒污泥古菌菌群較為單一，主要為甲烷鬃毛菌(Methanosaeta)、甲烷八疊球菌(Methanosarcina)和甲烷桿菌屬(Methanobacterium)；反應器R3中丁酸培養的厭氧顆粒污泥除了甲烷鬃毛菌外，優勢菌主要為甲烷桿菌屬。

反應器R2中乙酸進水培養的顆粒污泥中甲烷八疊球菌(Methanosarcina)為特有的種群，與同樣可以降解乙酸的甲烷鬃毛菌(Methanosaeta)相比，這種產甲烷菌可以適應高濃度的乙酸，因此在乙酸進水培養的顆粒污泥中形成優勢生長。反應器R3中丁酸進水培養的顆粒污泥中甲烷桿菌屬(Methanobacterium)的含量遠高于反應器R1和R2的顆粒污泥，該種屬主要利用H2，CO2和甲酸鹽[4]，這是由于長期以丁酸鹽為底物馴化的結果。

以上結果表明，厭氧顆粒污泥經過不同進水底物馴化后，占優勢生長的細菌和古菌為厭氧降解途徑的功能菌、水解酸化菌和嗜氫嗜乙酸的產甲烷菌。

圖10 不同底物培養的厭氧顆粒污泥中古菌分布圖

2.4 討論

由于厭氧消化涉及的水解酸化、產氫產乙酸、同型產乙酸和產甲烷四大微生物種群對有機物的降解會引起周圍微環境中pH值的改變，可以根據厭氧顆粒污泥內部pH梯度推斷不同種群微生物的空間分布，將pH微電極的測試結果與微生物種群分析的直接結果對照，可以得出更為準確的判斷。

根據表1產甲烷活性測試結果和圖9和圖10的16S rDNA測序分析結果，反應器R1中以蔗糖為底物培養的顆粒污泥內部微生物種群最為豐富，因此圖3微電極測試曲線中顆粒污泥內部pH值從表層到核心先降低(蔗糖水解酸化和VFA產氫產乙酸)，后升高(利用乙酸產甲烷)的趨勢，這說明在該種污泥中，水解酸化和產氫產乙酸菌分布在污泥外層，而利用乙酸的產甲烷菌分布在污泥核心。反應器R2中以乙酸為底物培養的顆粒污泥內部微生物種群最為簡單，細菌種群類別少，只能以乙酸鹽為底物的甲烷鬃毛菌(Methanosaeta)和甲烷八疊球菌(Methanosarcina)占古菌的近90%。由于能夠降解蔗糖和丁酸的細菌數量少，所以圖4中蔗糖和丁酸為測試底物時厭氧顆粒污泥內部pH值梯度很小。反應器R3中以丁酸為底物培養的顆粒污泥內部微生物種群較蔗糖污泥簡單，但比乙酸污泥復雜。在該種污泥中同樣能夠降解蔗糖的細菌數量少，所以圖5中蔗糖為測試底物時厭氧顆粒污泥內部pH值梯度很小。

因此，對照產甲烷活性和16S rDNA的分析結果可知，通過微電極對厭氧顆粒污泥內部pH值微環境的測試，可以得到其內部微生物種群的空間分布信息。

3 結論

采用微電極技術測試不同進水培養的厭氧顆粒污泥，可得到污泥內部微環境的pH值梯度，并推斷微生物種群的空間分布。微電極分析得到的結果與不同測試底物產甲烷活性結果和16S rDNA測序分析結果相一致，說明微電極技術可作為厭氧顆粒污泥內部微環境分析和微生物種群空間分布研究的有力工具。

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Study on Micro-environment within Anaerobic Granular Sludge Adopting Microelectrode Method /

LI Qing， LIU Fang， ZHANG Zhe， WANG Hui， YANG Shu-cheng /

(School of Energy and Power Engineering, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710049, China)

Three UASB reactors were operated continuously with sole carbon source of sucrose, acetate and butyrate, respectively. After the reactors were operated steadily, pH gradient within the three types of anaerobic granular sludge were analyzed with self-fabricated hydrogen-ion-selective liquid-film microelectrode. Specific methanogenic activities (SMA) of granular sludges were measured under different substrates. Moreover, microbial community structures of the granular sludges were also analyzed by 16S rDNA sequencing. The results indicated that pH gradient within the anaerobic granular sludge could be measured accurately by microelectrode, through which the spatial distribution of microbial community could be deduced. The results of microelectrode analysis was consistent with the analysis results of SMA and 16s rDNA sequence, which proved that microelectrode could be a useful tool for analyzing micro-environment and microbial community spatial distribution within anaerobic granular sludge.

anaerobic granular sludge; microelectrode; micro-environment; specific methanogenic activity

2016-10-14

項目來源： 國家自然科學基金資助項目(51308453)； 中央高校基本科研業務費專項資金資助項目(xjj2013078)

李 清(1991-)，女，碩士，主要從事廢物厭氧生物處理方面的研究工作，E-mail：516193241@qq.com

楊樹成，E-mail：yanyang@mail.xjtu.edu.cn

S216.4; X703

A

1000-1166(2017)02-0003-06