4種白腐菌預(yù)處理提高玉米秸稈厭氧消化性能研究

黃文博， 袁海榮， 劉春梅， 鄒德勛， 龐云芝， 李秀金

(北京化工大學(xué) 資源與環(huán)境工程研究中心， 北京 100029)

4種白腐菌預(yù)處理提高玉米秸稈厭氧消化性能研究

黃文博， 袁海榮， 劉春梅， 鄒德勛， 龐云芝， 李秀金

(北京化工大學(xué) 資源與環(huán)境工程研究中心， 北京 100029)

為提高玉米秸稈厭氧消化產(chǎn)氣性能，文章采用4種白腐菌(Pleurotusostreatus，Ceriporiopsissubvermispora，Trametesversicolor和Phanerochaetechrysosporium)對其進行預(yù)處理。通過測定白腐菌微生物生長曲線及進行厭氧消化實驗驗證，發(fā)現(xiàn)C.subvermispora預(yù)處理效果最佳，能夠在15天時間內(nèi)徑向完全覆蓋秸稈，生長速率大，為167.75 μm·h-1，對木質(zhì)素的相對選擇降解系數(shù)最高，為0.85。厭氧消化實驗結(jié)果顯示，C.subvermispora預(yù)處理玉米秸稈累積產(chǎn)甲烷量為225.94 L·kg-1VS，較未預(yù)處理提高了12.32%，T80產(chǎn)氣周期縮短8天。說明，C.subvermispora預(yù)處理能夠提高玉米秸稈厭氧消化產(chǎn)氣性能。

白腐菌； 玉米秸稈； 木質(zhì)纖維素； 相對選擇降解性； 厭氧消化

中國是農(nóng)業(yè)大國，2014年，我國秸稈總產(chǎn)生量約為8.3億噸，其中玉米秸稈所占比例約為30%[1]，具有巨大的應(yīng)用潛力。

秸稈中具有豐富的可利用木質(zhì)纖維素，其中，纖維素和半纖維素這兩種聚糖類物質(zhì)組成的碳水化合物(占干物質(zhì)總量的55%～75%)是主要的甲烷轉(zhuǎn)化組分。但是，木質(zhì)素通過與植物細胞壁中部分碳水化合物交聯(lián)，形成復(fù)雜的三維立體結(jié)構(gòu)，將纖維素和半纖維素包裹其中，形成生物質(zhì)抗降解屏障，具備一定疏水作用，大大降低了微生物對底物的接觸，以及初始分泌的酶的吸附和水解效率[2]。因此，采用高效的預(yù)處理方式對秸稈進行去木質(zhì)素處理，提高其可生物利用性，是目前秸稈類底物厭氧消化的關(guān)鍵。

秸稈預(yù)處理方式主要包括物理法、化學(xué)法、生物法和聯(lián)合預(yù)處理[3]。白腐菌預(yù)處理是生物法中的一種，因其高效去木質(zhì)作用和環(huán)境友好性而備受關(guān)注。Otjen[4]等以樺樹和桉樹為底物，評估30種白腐菌降解過程中的木質(zhì)素選擇降解性，實驗發(fā)現(xiàn)，白腐菌木質(zhì)素選擇降解性與菌種和底物種類均有一定關(guān)聯(lián)，木腐型白腐菌能夠在局部范圍內(nèi)完全降解木質(zhì)素并完整保留纖維素，而底物中碳水化合物與木質(zhì)素含量比值越高，越有利于木質(zhì)素的降解。自20世紀60年代起人們逐漸開始將白腐菌預(yù)處理應(yīng)用于厭氧消化技術(shù)的研究。Müller[5]等使用22種白腐菌預(yù)處理稻草，發(fā)現(xiàn)不同菌種對稻草中木質(zhì)纖維組分的選擇降解性有明顯差異，隨后將預(yù)處理后稻草與牛糞混合進行厭氧消化，結(jié)果顯示經(jīng)木質(zhì)素選擇降解性較高的菌種預(yù)處理的稻草產(chǎn)氣性能更好，Pleurotussp.“florida”預(yù)處理后產(chǎn)氣量為對照組2倍。López[6]等利用Phanerochaeteflavido-alba對幾種農(nóng)業(yè)和林業(yè)廢棄物進行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)纖維材料的種類對預(yù)處理的效果有一定影響，其木質(zhì)化程度越高，木質(zhì)素選擇降解性越高，預(yù)處理對其產(chǎn)氣性能的提高越明顯。Arora[7]等發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的麥秸經(jīng)同種白腐菌預(yù)處理，木質(zhì)素選擇降解性也存在差異。Lalak[8]等研究含水率對白腐菌預(yù)處理長穗偃麥草厭氧消化性能的影響，發(fā)現(xiàn)在65%含水率條件下，F(xiàn)lammulinavelutipes對木質(zhì)素的去除率最高，為35.4%，而對纖維素的保留程度最高，為79.52%，產(chǎn)氣量提高120%。由此可見，針對特定底物和預(yù)處理條件選擇相應(yīng)的高木質(zhì)素選擇性菌種，是提高厭氧消化產(chǎn)氣性能的關(guān)鍵。

因此，筆者實驗采用Pleurotusostreatus，Ceriporiopsissubvermispora，Trametesversicolor和Phanerochaetechrysosporium4種白腐菌預(yù)處理玉米秸稈，通過預(yù)處理過程中微生物生長曲線和木質(zhì)纖維素組分變化，篩選最適預(yù)處理菌種，進行厭氧消化實驗驗證，并結(jié)合模型擬合的方式進行分析，以提高玉米秸稈厭氧消化產(chǎn)氣性能。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用菌種Pleurotusostreatus(ACCC 52857)，Ceriporiopsissubvermispora(ACCC 32475)購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，Phanerochaetechrysosporium(CICC 40299)，Trametesversicolor(CICC 50001)購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

實驗所用玉米秸稈取自北京市延慶區(qū)，接種物取自北京市順義區(qū)某沼氣站，其主要性質(zhì)示于表1中。

1.2 實驗方法

1.2.1 接種物的培養(yǎng)

菌種的培養(yǎng)采用綜合PDA培養(yǎng)基：20%馬鈴薯汁1000 mL，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，硫胺素(VitB1)微量，瓊脂15 g，自然pH值。平板擴增，25℃～28℃培養(yǎng)5天。

1.2.2 白腐菌生長曲線的測定

表1 原料及接種物性質(zhì)

根據(jù)Santi[9]等所用方法，含水率為65%的滅菌玉米秸稈接種直徑9 mm菌塊1塊，置于直徑90 mm培養(yǎng)皿，自然pH值，25℃～28℃下培養(yǎng)15天[10-11]，測量24 h菌絲徑向覆蓋區(qū)域直徑變化。

Kr=(R1-R0)/(t1-t0)

(1)

式中：R0，R1為t0和t1時菌落半徑，cm。

R(t)=a/[1+bexp(-kt)]

(2)

式中：R(t)為時間t時菌落半徑，cm；T為菌落生長時間，d。

生長曲線Slogistic模型[13]由公式(3)計算所得。

(3)

1.2.3 木質(zhì)纖維素含量變化測定

含水率為65%的玉米秸稈置于17 cm×33 cm×5 cm聚丙烯袋，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌處理30 min后接種直徑9 mm菌塊3塊，自然pH值，28℃預(yù)處理15天，測定預(yù)處理結(jié)束后秸稈木質(zhì)纖維素含量。

白腐菌木質(zhì)纖維素選擇降解系數(shù)Srel[14]可由公式(4)計算得到。

(4)

式中：L1為木質(zhì)纖維素初始含量，%；L2為預(yù)處理后木質(zhì)纖維素含量，%；WL為失重，%。

1.2.4 厭氧消化產(chǎn)氣性能實驗

含水率為65%的玉米秸稈置于17cm×33cm×5cm聚丙烯袋，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌處理30min后接種直徑9mm菌塊3塊，自然pH值，28℃預(yù)處理15天，對照組為未經(jīng)預(yù)處理玉米秸稈。厭氧消化實驗采用1L藍蓋瓶，工作體積800mL。秸稈有機負荷為50gTS·L-1，接種污泥有機負荷為15gMLSS·L-1，pH值為6.8～7.2。實驗組與對照組均設(shè)3重復(fù)。

TS和VS根據(jù)AmericanPublicHealthAssociation(APHA) 中推薦的方法進行[15]。厭氧消化過程產(chǎn)氣量采用排水法測定；所得氣體組分含量采用氣相色譜(北分，SP-2100A)測定(TDX-01填充柱，TCD檢測器)。pH值采用Orion3-Star型pH計測定。木質(zhì)纖維素含量采用全自動纖維分析儀(ANKOM2000I)測定。

累積產(chǎn)甲烷量Gompertz模型可由公式(5)[16]計算得到。

式中：P(t)為累積產(chǎn)甲烷量，L·kg-1VS；Pm為擬合產(chǎn)甲烷潛力，L·kg-1VS；Rm為最大產(chǎn)甲烷率，L·kg-1VSd-1；λ為延滯期，d。

2 結(jié)果與討論

2.1 白腐菌預(yù)處理效果的研究

2.1.1 生長曲線的測定與擬合

白腐菌能夠在玉米秸稈上生長，并同時通過木質(zhì)素降解酶系的協(xié)同作用對其進行生物降解和轉(zhuǎn)化。但是不同種類的白腐菌在玉米秸稈上的生長情況具有明顯差異。

圖1和圖2分別為不同種類白腐菌在玉米秸稈上的生長曲線及其Slogistic模型擬合。圖3～圖6為菌絲具體生長情況。可以看出，在15天實驗周期中，不同白腐菌在玉米秸稈上菌絲生長情況均有所不同，大致可分為兩類，C.subvermispora和P.ostreatus生長較快，其中，C.subvermispora在第11天首先達到徑向完全覆蓋(9cm)，P.ostreatus在第12天達到徑向完全覆蓋。T.versicolor，P.chrysosporium生長較慢，12天時菌落均停止擴增，覆蓋范圍分別為5.7cm和5cm。

圖1 T.versicolor，P.chrysosporium，C.subvermispora和P.ostreatus在玉米秸稈上菌絲生長曲線

圖2 T.versicolor，P.chrysosporium，C.subvermispora和P.ostreatus在玉米秸稈上生長曲線Slogistic模型擬合

圖3 T.versicolor在玉米秸稈上菌絲生長情況

圖4 P.chrysosporium在玉米秸稈上菌絲生長情況

圖5 C.subvermispora在玉米秸稈上菌絲生長情況

圖6 P.ostreatus在玉米秸稈上菌絲生長情況

表2所列不同菌種徑向生長速率Kr和生長曲線Slogistic模型擬合所得參數(shù)也證明了這一結(jié)果。

表2 不同菌種生長曲線Slogistic模型擬合參數(shù)及徑向生長速率Kr

真菌預(yù)處理應(yīng)該在盡可能短的周期內(nèi)達到對整個秸稈的完全覆蓋，降解木質(zhì)素的同時盡可能少的消耗纖維素和半纖維素，由此可見，能夠在15天時間內(nèi)完全覆蓋秸稈，徑向生長速率大，快增期短的C.subvermispora較適宜在玉米秸稈上生長和作為預(yù)處理菌種使用。

2.1.2 木質(zhì)纖維素含量變化測定

由于不同菌種在玉米秸稈上的菌落生長情況有較大差異，因此，對其預(yù)處理過程中木質(zhì)纖維素含量的變化進行考察，探尋不同菌種預(yù)處理過程中對木質(zhì)纖維素降解的效果。可以看出，經(jīng)15天預(yù)處理后，不同菌種對玉米秸稈木質(zhì)纖維素組分降解效果具有明顯差異。白腐菌對木質(zhì)纖維素的降解大致可分為選擇性降解和非選擇性降解兩種類型[4]。由圖7可以看出，P.chrysosporium對玉米秸稈木質(zhì)纖維素各組分的降解不具備選擇性，對纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解率基本相同，而其余3種菌種對木質(zhì)素的降解率明顯高于纖維素和半纖維素，更具選擇性，其中，T.versicolor對木質(zhì)素的降解率最高，達到60.98%。

圖7 不同菌種預(yù)處理玉米秸稈木質(zhì)纖維素降解效果

圖8 不同菌種預(yù)處理玉米秸稈TS和VS降解率

白腐菌木質(zhì)纖維素選擇降解系數(shù)Srel能夠直觀反映白腐菌對木質(zhì)素降解的專一性。圖8表明T.versicolor和P.chrysosporium對秸稈VS降解率最高，分別為18.08%和19.81%，且T.versicolor對木質(zhì)素的降解率也是最高，但由計算所得Srel值發(fā)現(xiàn)，T.versicolor和P.chrysosporium的木質(zhì)素選擇降解性并不好。盡管C.subvermispora對玉米秸稈組分整體的降解效果(TS和VS降解率)并不是最高，但由圖9和圖10中Srel對應(yīng)木質(zhì)素降解率和干物質(zhì)降解率的分布情況可以看出，在木質(zhì)素和干物質(zhì)損失較小的情況下，C.subvermispora的Srel值最高，為0.85，表明其降解木質(zhì)素的專一性和效率高于其他菌種。相反，P.chrysosporium對秸稈整體降解率最高，但對木質(zhì)素的選擇性最差，只有0.36，表明這種菌種對木質(zhì)纖維素不同組分的降解并無針對性。這與不同菌種在玉米秸稈上的生長速率具有一定關(guān)聯(lián)性，由于C.subvermispora在秸稈上的增長速率最高，能夠快速覆蓋秸稈，對秸稈整體降解率較低，但對包裹在最外層的木質(zhì)素降解較完全。P.chrysosporium徑向擴增慢，除降解木質(zhì)素外，還消耗了大量的纖維素與半纖維素。

圖9 不同菌種預(yù)處理玉米秸稈木質(zhì)素選擇降解系數(shù)(相對木質(zhì)素降解率)

圖11 不同菌種預(yù)處理玉米秸稈纖維素選擇降解系數(shù)(相對纖維素降解率)

纖維素和半纖維素的構(gòu)成單體主要為糖類，是主要的甲烷轉(zhuǎn)化組分，因此在預(yù)處理階段，對這兩種組分進行斷鏈和解聚，而降解后產(chǎn)物應(yīng)盡可能保留，減少消耗[2]。由圖11～圖14中，不同菌種纖維素、半纖維素選擇降解系數(shù)看出，C.subvermispora雖然對半纖維素有較強選擇降解性，但對纖維素的保留程度最高，F(xiàn)ernandez Fueyo[17]等研究認為C.subvermispora在降解過程中，調(diào)控錳過氧化物酶的基因的表達要高于其他菌種，而調(diào)控多糖水解酶的基因表達相對較少，因此使其對木質(zhì)素的降解更具選擇性。

綜上所述，C.subvermispora對木質(zhì)素的選擇降解效果最為明顯，對玉米秸稈的預(yù)處理效果最佳。

2.2 厭氧消化產(chǎn)氣效果的研究

日產(chǎn)甲烷量和甲烷含量能夠直觀的反映厭氧消化過程的穩(wěn)定性和各階段的變化趨勢。由圖15日產(chǎn)甲烷量可以看出，不同菌種預(yù)處理玉米秸稈在厭氧消化過程中反應(yīng)更加平穩(wěn)，無明顯的產(chǎn)氣高峰和酸化現(xiàn)象產(chǎn)生。甲烷轉(zhuǎn)化主要集中在前20天左右。而未預(yù)處理秸稈則由于酸化現(xiàn)象在初始階段產(chǎn)生了7天左右的延滯，反應(yīng)過程中有明顯的3個產(chǎn)氣高峰，波動性較大。圖16所示甲烷含量變化可以看出，經(jīng)白腐菌預(yù)處理玉米秸稈在厭氧消化過程中能夠更快進入穩(wěn)定的甲烷化階段，甲烷含量穩(wěn)定在60%左右的時間更長，而未預(yù)處理秸稈甲烷含量波動較為明顯，直到25天后才趨于穩(wěn)定。因此表明，白腐菌預(yù)處理能夠加快厭氧消化甲烷化進程，提高反應(yīng)的穩(wěn)定性，不同菌種預(yù)處理變化趨勢基本相同。

圖10 不同菌種預(yù)處理玉米秸稈木質(zhì)素選擇降解系數(shù)(相對干物質(zhì)降解率)

圖12 不同菌種預(yù)處理玉米秸稈纖維素選擇降解系數(shù)(相對干物質(zhì)降解率)

圖13 不同菌種預(yù)處理玉米秸稈半纖維素選擇降解系數(shù)(相對半纖維素降解率)

圖15 不同菌種預(yù)處理厭氧消化日產(chǎn)甲烷量

厭氧消化累積產(chǎn)甲烷量和T80產(chǎn)氣周期是反映厭氧消化產(chǎn)氣性能和工業(yè)應(yīng)用可行性的兩個重要指標[18]。對4種不同菌種預(yù)處理玉米秸稈進行周期45天的厭氧消化實驗，其累積產(chǎn)甲烷量和累積產(chǎn)甲烷量Gompertz模型擬合分析分別示于圖17和圖18和表3中。

由圖17可以看出，不同菌種預(yù)處理厭氧消化45天累積產(chǎn)甲烷量具有明顯差異，其中，C.subvermispora預(yù)處理玉米秸稈累積產(chǎn)甲烷量最高，為225.94 L·kg-1VS，較未預(yù)處理提高了12.32%。其余3種菌種預(yù)處理后累積產(chǎn)甲烷量均有一定程度的降低。根據(jù)預(yù)處理實驗結(jié)果分析，認為纖維素和半纖維素的損耗可能是導(dǎo)致這一結(jié)果的主要原因。Feng Xinmei[19]等對Pleurotusostreatus和Pleurotuseryngii兩種歐洲和亞洲常見食用菌預(yù)處理麥秸的厭氧消化實驗也得到了類似的結(jié)果，表明白腐菌預(yù)處理對秸稈中纖維素和半纖維素的消耗是影響其甲烷產(chǎn)量的主要原因。

圖14 不同菌種預(yù)處理玉米秸稈半纖維素選擇降解系數(shù)(相對干物質(zhì)降解率)

圖16 不同菌種預(yù)處理厭氧消化甲烷含量

圖17 不同菌種預(yù)處理厭氧消化累積產(chǎn)甲烷量

圖18 不同菌種預(yù)處理厭氧消化累積甲烷產(chǎn)量Gompertz模型擬合

白腐菌預(yù)處理能夠有效破壞秸稈木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)，使其更易被厭氧微生物所利用，這一優(yōu)勢主要體現(xiàn)在對T80產(chǎn)氣周期的影響上。圖17可以看出，不同菌種預(yù)處理均可加快厭氧消化進入甲烷化的進程，T80產(chǎn)氣周期較未預(yù)處理提高了8～9天。表3中Gompertz模型擬合參數(shù)λ表示厭氧消化延滯期，可以看出，經(jīng)白腐菌預(yù)處理后延滯期縮短8～9天，與T80產(chǎn)氣周期結(jié)果一致，這也能夠在一定程度上彌補前期預(yù)處理時間的損耗，使白腐菌預(yù)處理具備一定的應(yīng)用可行性。

表3 不同菌種預(yù)處理厭氧消化累積產(chǎn)甲烷量Gompertz模型擬合參數(shù)

綜合累積產(chǎn)甲烷量和T80產(chǎn)氣周期兩項指標考慮，C.subvermispora能夠提高玉米秸稈厭氧消化產(chǎn)氣性能，這一結(jié)果與預(yù)處理效果的研究結(jié)論一致。

2.3 厭氧消化過程生物降解性與物質(zhì)轉(zhuǎn)化

對不同白腐菌預(yù)處理玉米秸稈厭氧消化過程中物質(zhì)轉(zhuǎn)化分析，能夠直觀的反映厭氧消化過程中木質(zhì)纖維素不同組分甲烷轉(zhuǎn)化的程度，從而解釋白腐菌預(yù)處理如何影響玉米秸稈厭氧消化產(chǎn)氣性能。

將玉米秸稈中有機組分采用概化分子式CaHbOcNd表示理論甲烷產(chǎn)量是當(dāng)?shù)孜锿耆D(zhuǎn)化成甲烷時的最大體積(標況下)。根據(jù)文獻，秸稈的理論甲烷產(chǎn)量可通過經(jīng)驗方程(公式6和公式7)得到[20]。生物降解性可由公式8得到。

(6)

(7)

(8)

式中：VT為理論產(chǎn)甲烷量，L·kg-1VS； Vc為累積產(chǎn)甲烷量，L·kg-1VS。

結(jié)合元素分析，計算得到不同菌種預(yù)處理后和未預(yù)處理玉米秸稈理論產(chǎn)甲烷量和生物降解性示于表4中。可以看出，經(jīng)白腐菌預(yù)處理后，由于碳源的損失，玉米秸稈的理論產(chǎn)甲烷量均有不同程度的降低。C.subvermispora預(yù)處理后秸稈的生物降解性較未預(yù)處理提高了20.38%，其他3種菌種預(yù)處理后均導(dǎo)致生物降解性一定程度的降低。通過厭氧消化前后木質(zhì)纖維素組分的降解情況計算得到纖維素、半纖維素和木質(zhì)素在厭氧消化過程中對甲烷的轉(zhuǎn)化貢獻率，發(fā)現(xiàn)經(jīng)白腐菌預(yù)處理后，各木質(zhì)纖維素組分甲烷轉(zhuǎn)化貢獻率均低于未預(yù)處理組，表明了白腐菌預(yù)處理雖然破壞了木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)，但降解過程中同樣會消耗一部分可用于厭氧消化的有效碳源組分使得各組分甲烷轉(zhuǎn)化率和整體生物降解性受到影響。綜上所述，C.subvermispora能夠強化玉米秸稈厭氧消化產(chǎn)氣性能。

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)在預(yù)處理階段C.subvermispora能夠在15天時間內(nèi)完全覆蓋玉米秸稈，徑向生長速率大，為167.75μm·h-1，快增期短，Srel最高為0.85，預(yù)處理效果最好，通過厭氧消化產(chǎn)甲烷性能驗證發(fā)現(xiàn)，C.subvermispora能夠提高累積產(chǎn)甲烷量12.32%，縮短T80產(chǎn)氣周期8天，提高生物降解性20.38%，能夠提高玉米秸稈厭氧消化產(chǎn)氣性能。

表4 不同菌種預(yù)處理厭氧消化過程中物質(zhì)轉(zhuǎn)化

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Pretreatment Comparison of Corn Stover by Different Kind of White-rot Fungi for Improving Biomethane Production /

HUANH Wen-bo, YUAN Hai-rong, LIU Chun-mei, ZOU De-xun, PANG Yun-zhi, LI Xiu-jin /

(Beijing City Environmental Pollution Control and Resource Reuse Engineering Research Center, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China)

Pretreatment of corn stover byPleurotusostreatus,Ceriporiopsissubvermispora,TrametesversicolorandPhanerochaetechrysosporiumwere studied in this paper for enhancing biomethane production.C.subvermisporawas able to fully colonize the corn stover in 15 days and had the highest radial growth rate of 167.75μm·h-1. And its relative selectivity to lignin was 0.85, which was better than the other three strains. The cumulative biomethane production of pretreated corn stover byC.subvermisporawas 225.94 L·kg-1VS, which was 12.32% higher than that of untreated. And the digestion period (T80) was 8 days, which was shorter than that of untreated. Therefore,C.subvermisporawas the optimal strain for pretreatment of corn stover for biomethane production.

white-rot fungi; corn stover; lignocellulose; relative selectivity; anaerobic digestion

2016-10-14

項目來源： 科技部十二五科技支撐計劃(2014BAC24B01;2014BAL05B03;2015BAD21B03)

黃文博(1991- )，女，北京石景山人，博士，主要從事固體廢物資源化利用方面的科研工作，E-mail:iorhwb@163.com

李秀金，E-mail:xjli@mail.buct.edu.cn

S216.4； X712

A

1000-1166(2017)02-0028-08