氟及7-NI共培養的SH-SY5Y細胞nNOS表達、增殖情況觀察

鄧明芬，朱丹，桂傳枝,2，官志忠,3(貴州醫科大學病理學教研室，貴陽 550004；2貴州省腫瘤醫院；3貴州省分子生物學重點實驗室)

氟及7-NI共培養的SH-SY5Y細胞nNOS表達、增殖情況觀察

鄧明芬1，朱丹1，桂傳枝1,2，官志忠1,3
(1貴州醫科大學病理學教研室，貴陽 550004；2貴州省腫瘤醫院；3貴州省分子生物學重點實驗室)

目的 觀察氟及神經型一氧化氮合成酶(nNOS)特異性抑制劑7-硝基吲唑(7-NI)共培養的SH-SY5Y細胞增殖情況和nNOS表達變化。方法 將體外培養SH-SY5Y細胞分為對照組、低氟組、高氟組、7-NI組、低氟+7-NI組、高氟+7-NI組，每組6個復孔。低氟組加入0.2 mmol/L NaF，高氟組加入2.0 mmol/L NaF，7-NI組加入1 μmol/L 7-NI，低氟+7-NI組加入0.2 mmol/L NaF和1μmol/L 7-NI，高氟+7-NI組加入2.0 mmol/L NaF和1 μmol/L 7-NI，對照組加入等體積培養液，繼續培養24 h。采用CCK-8法檢測各組SH-SY5Y細胞增殖情況(以OD450表示)；采用實時熒光定量 PCR 法檢測各組SH-SY5Y細胞NOS mRNA；采用Western blotting法檢測各組SH-SY5Y細胞NOS 蛋白。結果 低氟組、高氟組細胞OD450均低于對照組(P均<0.05)，且高氟組細胞OD450低于低氟組(P<0.05)；7-NI組細胞OD450與對照組相比P>0.05；低氟+7-NI組細胞OD450高于低氟組(P<0.05)；高氟+7-NI組細胞OD450高于高氟組(P<0.05)。低氟組、高氟組細胞nNOS mRNA和蛋白相對表達量均高于對照組(P均<0.05)，且高氟組細胞nNOS mRNA和蛋白相對表達量均高于低氟組(P均<0.05)；7-NI組細胞nNOS mRNA和蛋白相對表達量均低于對照組(P均<0.05)；低氟+7-NI組細胞nNOS mRNA和蛋白相對表達量均低于低氟組(P<0.05)；高氟+7-NI組細胞nNOS mRNA和蛋白相對表達量均低于高氟組(P<0.05)。結論 氟可以抑制SH-SY5Y細胞增殖，7-NI共培養可以減輕氟對SH-SY5Y細胞的增殖抑制作用。

氟;氟中毒；人神經母細胞瘤細胞；7-硝基吲唑；神經型一氧化氮合成酶；一氧化氮

氟中毒可以引起機體多個系統和器官的損害。在神經系統，氟能透過血腦屏障進入腦組織，過量的氟可引起腦組織內自由基含量增加和抗氧化酶活性下降，使機體處于氧化應激狀態，引起神經系統損害[1～5]。一氧化氮(NO)是具有生物活性的自由基之一，與氧自由基關系密切。機體內的NO主要是在一氧化氮合成酶(NOS)作用下，以L-精氨酸為底物合成的。NOS分神經型NOS(nNOS)、內皮細胞型NOS(eNOS)和白細胞/巨噬細胞性NOS(iNOS)。nNOS廣泛存在于大腦皮層、海馬和杏仁核等神經細胞中。nNOS可被Ca2+激活，過多的nNOS可合成大量NO，在體內NO可與超氧陰離子快速結合生成過氧亞硝基陰離子(ONOO-)，引起細胞和組織損傷，從而參與腦損傷過程[4，5]。另有研究報道氟可誘導BV-2小膠質細胞內的NO的釋放增多，且這種誘導作用能被iNOS抑制劑SMT所阻斷[6]。因此，NO和NOS有可能參與氟中毒性神經損傷的發病機制[7]。 SH-SY5Y細胞是神經母細胞瘤患者的轉移骨瘤灶細胞SK-N-SH經3次克隆后的亞系[8]，屬腫瘤細胞，但細胞形態、生理及生化功能與神經元具有相似性[9]，目前已被作為神經元替代細胞廣泛用于替代神經元進行神經系統疾病的研究。7-硝基吲唑(7-NI)是特異性nNOS抑制劑。為進一步明確染氟對SH-SY5Y細胞增殖的影響及nNOS在其中發揮的作用，本研究觀察了染氟及7-NI共培養的SH-SY5Y細胞增殖情況和nNOS表達變化。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑與儀器 SH-SY5Y 細胞，氟化鈉(NaF)溶液、7-NI均購于美國Sigma公司，細胞增殖-毒性檢測試劑盒(簡稱CCK-8)購于日本Dojindo 公司。BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司，兔抗人 nNOS單克隆抗體、鼠抗人 β-actin(內參照)單克隆抗體均自美國 Abcam 公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG(H + L)、山羊抗鼠 IgG(H + L)均購自碧云天生物技術研究所，ECL 試劑盒購自美國Millipore 公司。RNA 提 取 試 劑 TRIzol購自Invitrogen公司，Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒及SYBR 熒光染料均購自Thermo Fisher Scientific公司； nNOS基因及內參照β-actin基因的 PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。ELX800UV酶標儀(美國Bio-Rad公司)，實時熒光定量 PCR 儀(美國 BD 公司產品)。

1.2 細胞分組及NaF、7-NI應用方法 用含10%胎牛血清和1%雙抗的高糖DMEM培養液培養SH-SY5Y細胞，培養條件為37 ℃、5%CO2。取生長對數期SH-SY5Y細胞接種于96孔板，每孔100 μL細胞懸液，細胞密度1×104/mL。設對照組、低氟組、高氟組、7-NI組、低氟+7-NI組、高氟+7-NI組，每組6個復孔。低氟組加入0.2 mmol/L NaF，高氟組加入2.0 mmol/L NaF，7-NI組加入1 μmol/L 7-NI，低氟+7-NI組加入0.2 mmol/L NaF和1 μmol/L 7-NI，高氟+7-NI組加入2.0 mmol/L NaF和1 μmol/L 7-NI，對照組加入等體積培養液，繼續培養24 h。

1.3 各組細胞增殖情況觀察 各孔加入CCK-8試劑10 μL，37 ℃、5%CO2培養箱內培養2 h，在 ELx800UV 酶標儀波長450 nm 處檢測各孔的吸光度(OD450)值。實驗重復3次。

1.4 各組細胞nNOS mRNA和蛋白檢測 ①nNOS mRNA：采用實時熒光定量 PCR 法。收集各組細胞，采用TRIzol、氯仿、異丙醇等試劑提取細胞的總RNA，用核酸蛋白定量儀檢測RNA的純度及濃度。參照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA。反應體系為：3 μg總RNA、1 μL Oligo(dT)18 primer，最后加超純水至總體積為12 μL，65 ℃水浴5 min，加入4 μL 5×Reaction Buffer、1 μL Ribolck RNase Inhibitor、2 μL 10 mM dNTP Mix、1 μL RevertAid M- MuLV RT，至總反應體系為20 μL。反應條件為：42 ℃孵育60 min，70 ℃加熱5 min，4 ℃降溫保存；將轉錄所得的cDNA置于-80 ℃保存，備用。以上述cDNA為模板，行實時熒光定量PCR檢測。反應體系為：2 μL cDNA、10 μL SYBR Green PCR Maser mix、上下游引物各1 μL、6 μL超純水，總反應體系為20 μL。nNOS正向引物5′-TCCAGAACTCACACAAGGT-3′，反向引物5′-GGAGACGCACGAAGATAG-3′，擴增片段長度168 bp；內參照β-actin正向引物5′-CTACCTCATGAAGATCCTCACCGA-3′，反向引物5′-TTCTCCTTAATGTCACGCACGATT-3′，擴增片段長度590 bp。反應條件如下：第一步95 ℃解鏈10 min；，第二步95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共40個循環。采用2-ΔΔCt值表示nNOS mRNA的相對表達量。②nNOS蛋白：采用Western blotting法。收集各組細胞，用RIPA 裂解液裂解并提取蛋白，采用BCA法進行蛋白定量；蛋白質上樣量為25 μg每孔，制8% SDS-PAGE分離膠分離蛋白，將分離后的蛋白質電轉移至0.22 μm硝酸纖維素(PVDF)膜上，封閉液室溫下封閉處理1 h，分別加入一抗[兔抗人 nNOS 單克隆抗體(體積稀釋比例為1∶1 000)、鼠抗人β-actin單克隆抗體(內參照,體積稀釋比例為1∶10 000)]，將載有蛋白的PVDF膜置于冰袋之上，于搖床上反應過夜；PBST洗滌3次，分別加入二抗[辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG(H + L)和辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠 IgG(H+L，體積稀釋比例均為 1∶1 000]于室溫下搖床上反應1 h；PBST洗滌3次，采用 ECL試劑盒進行發光反應顯色，膠片曝光；使用Image J 軟件進行圖像分析，以nNOS蛋白條帶與內參照β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示各組nNOS蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 各組細胞OD450比較 對照組、低氟組、高氟組、7-NI組、低氟+7-NI組、高氟+7-NI組OD450分別為0.85±0.01、0.71±0.01、0.44±0.03、0.81±0.02、0.80±0.02、0.71±0.04。低氟組、高氟組細胞OD450均低于對照組(P均<0.05)，且高氟組細胞OD450低于低氟組(P<0.05)；7-NI組細胞OD450與對照組相比P>0.05；低氟+7-NI組細胞OD450高于低氟組(P<0.05)；高氟+7-NI組細胞OD450高于高氟組(P<0.05)。

2.2 各組細胞nNOS mRNA和蛋白比較 各組細胞nNOS mRNA和蛋白見表1。由表1可見，低氟組、高氟組細胞nNOS mRNA和蛋白相對表達量均高于對照組(P均<0.05)，且高氟組細胞nNOS mRNA和蛋白相對表達量均高于低氟組(P均<0.05)；7-NI組細胞nNOS mRNA和蛋白相對表達量均低于對照組(P均<0.05)；低氟+7-NI組細胞nNOS mRNA和蛋白相對表達量均低于低氟組(P<0.05)；高氟+7-NI組細胞nNOS mRNA和蛋白相對表達量均低于高氟組(P<0.05)。

3 討論

氟是活性最強的鹵族化學元素，是一種強氧化劑和氟化劑。氟元素廣泛存在于我們的生活環境之中，人體可通過不同途徑如空氣、食物、飲水等將之攝入體內，適量的氟可以滿足機體生理所需，而過量的氟則會在體內聚集引起氟中毒。地方性氟中毒則是由于當地居民長期生活在高氟環境(飲水、燃煤、磚茶等)中，導致人體的多個器官系統的病變[1]。前期的研究表明[2，3,10,11]，氟中毒可致大鼠神經系統損害，仔鼠學習和記憶能力下降；氟中毒能導致神經系統的損害，但其發病機制尚不十分清楚。且如今尚存許多地方性氟中毒患者，仍然缺乏治療地方性氟中毒的相關藥物。NO具有多種生物活性，在體內由NOS催化合成。NOS在體內按其來源不同分為nNOS、eNOS和iNOS三種類型，其中nNOS主要存在神經元中。NO可以在神經細胞之間傳遞信息，影響早期的記憶及學習功能。NO也是具有很強活性的自由基，過量的NO可在體內與活性氧發生反應生成強效氧化劑硝基過氧化物，后者參與體內氧化應激反應引起機體損傷。本研究結果顯示，低氟組、高氟組SH-SY5Y細胞OD450均低于對照組，且高氟組SH-SY5Y細胞OD450低于低氟組；低氟組、高氟組SH-SY5Y細胞nNOS mRNA和蛋白相對表達量均高于對照組，且高氟組SH-SY5Y細胞nNOS mRNA和蛋白相對表達量均高于低氟組。提示染氟對SH-SY5Y細胞增殖有抑制作用，且染氟量高者細胞增殖活性低；這種作用可能是由于染氟的SH-SY5Y細胞nNOS mRNA和蛋白表達升高。氟可使大鼠腦組織及神經細胞中NOS活性增高[7,10]，引起中樞神經興奮，神經系統NOS活性的增高可催化合成過多的NO，過量的NO在神經系統中蓄積，作為自由基與體內活性氧發生反應生成強效氧化劑硝基過氧化物，參與體內氧化應激反應引起機體損傷。

表1 各組細胞nNOS mRNA和蛋白表達比較

注：與對照組相比，*P<0.05；與低氟組相比，#P<0.05；與高氟組相比，※P<0.05。

NO是具有很強活性的自由基，過量的NO可在體內與活性氧發生反應生成強效氧化劑硝基過氧化物，后者參與體內氧化應激反應引起機體損傷。nNOS主要存在神經元中，過量的Ca2+可激活體內多余的nNOS，引起神經元的損傷和死亡[4，5]，這可能與被激活的nNOS催化產生過量的NO有關。本研究結果顯示，低氟組、高氟組SH-SY5Y細胞OD450均低于對照組，且高氟組SH-SY5Y細胞OD450低于低氟組；低氟組、高氟組SH-SY5Y細胞nNOS mRNA和蛋白相對表達量均高于對照組，且高氟組SH-SY5Y細胞nNOS mRNA和蛋白相對表達量均高于低氟組。提示染氟對SH-SY5Y細胞增殖有抑制作用，且染氟量高者細胞增殖活性低；這種作用可能是由于染氟使SH-SY5Y細胞nNOS mRNA和蛋白表達升高，NOS活性增高[11,12]，引起細胞內NO釋放過多[6]。

7-NI是一種具有較強選擇性的nNOS抑制劑，具有保護神經元的作用，且對許多疾病都顯示出了一定的療效。作為nNOS特異性抑制劑，7-NI主要通過抑制nNOS活性，阻斷NO在體內的主要合成途徑，減少NO等自由基在體內的蓄積和釋放，從而抑制內質網應激途徑，減輕氧化應激損傷，減少神經元死亡，從而產生神經元保護作用[13,14]。本研究結果顯示，7-NI組SH-SY5Y細胞OD450與對照組相比P>0.05，但7-NI組SH-SY5Y細胞nNOS mRNA和蛋白相對表達量低于對照組。提示7-NI共培養可以抑制SH-SY5Y細胞nNOS mRNA和蛋白表達，但對SH-SY5Y細胞增殖無影響。低氟+7-NI組SH-SY5Y細胞OD450高于低氟組，高氟+7-NI組SH-SY5Y細胞OD450高于高氟組；低氟+7-NI組SH-SY5Y細胞nNOS mRNA和蛋白相對表達量低于低氟組，高氟+7-NI組SH-SY5Y細胞nNOS mRNA和蛋白相對表達量低于高氟組。提示7-NI共培養可以減輕染氟對SH-SY5Y細胞增殖的抑制作用，這可能與7-NI抑制染氟導致的SH-SY5Y細胞nNOS mRNA和蛋白表達上調有關。本研究結果提示，NO/nNOS在氟中毒所致神經系統損傷中起著一定作用，并且這種損傷作用可被nNOS的特異性抑制劑7-NI所阻斷，這可能對地方性氟中毒神經系統損害藥物治療的研究提供了一條新思路和新靶點。

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Cell proliferation and nNOS expression in SH-SY5Y cells with co-cultivation of fluorosis and 7-nitroindazole

DENGMingfen1,ZHUDan,GUIChuanzhi,GUANZhizhong

(1DepartmentofPathology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

Objective To observe the cell proliferation and neuronal nitric oxide synthase (nNOS) expression in human neuroblastoma (SH-SY5Y) cells with co-cultivation of fluorosis and 7-nitroindazole. Methods SH-SY5Y cells cultured in vitro were divided into six groups, the control group, low-and high-dose fluoride exposure groups (0 mmol/L NaF, 0.2 mmol/L NaF and 2.0 mmol/L NaF), 7-NI group, low-and high-dose fluoride exposure combined with 7-NI groups (1 μmol/L 7-NI, 0.2 mmol/L NaF+1 μmol/L 7-NI , and 2.0 mmol/L NaF+1 μmol/L 7-NI), and cells in the above groups were treated for 24 h, and setting six holes in each group. The proliferation of SH-SY5Y cells was detected by CCK-8 (shown as OD450). The expression levels of nNOS mRNA and protein were detected by real-time fluorescent quantitative PCR and Western blotting.Results Compared with the control group, low-and high-dose fluoride exposure groups exhibited significantly lower OD450of SH-SY5Y cells (all P<0.05), while there was no statistically significant difference in 7-NI group (P>0.05). Compared with the low-dose fluoride group, the high-dose fluoride group exhibited significantly lower OD450(P<0.05). Compared with the cells only treated with NaF, the OD450of SH-SY5Y cells in the fluoride combined with 7-NI groups were significantly increased (allP<0.05). Compared with the control group, the expression levels of nNOS mRNA and protein in the low-and high-dose fluoride groups were significantly increased (allP<0.05), and the high-dose fluoride group was significantly higher than low-dose fluoride fluoride group (P<0.05). Compared with cells only treated with NaF, the expression levels of nNOS mRNA and protein in the fluoride combined with 7-NI groups were significantly decreased (allP<0.05).Conclusion Fluoride can inhibit the proliferation of SH-SY5Y cells, and co-cultivation of fluorosis and 7-nitroindazole can reduce the inhibitory effect of fluoride on the proliferation of SH-SY5Y cells.

fluorine; fluorosis; human neuroblastoma cells; 7-nitroindazole; neuronal nitric oxide synthase; nitric oxide

國家自然科學基金資助項目(81460482)；教育部博士學科點專項科研基金資助項目(20115215120003)。

鄧明芬(1991-)，女，碩士在讀，主要研究方向為地方病病理學。E-mail： 1250104629@qq.com

桂傳枝(1972-)，女，博士，教授，主要研究方向為地方性氟中毒。E-mail： guichuanzhi07@sina.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.11.007

R995；R977.3；R994.6

A

1002-266X(2017)11-0022-04

2016-11-18)