青蒿素灌胃對順鉑致小鼠急性腎損傷的防治作用觀察

安英，李強，隋春紅，王程(吉林醫(yī)藥學院，吉林吉林 132013)

青蒿素灌胃對順鉑致小鼠急性腎損傷的防治作用觀察

安英，李強，隋春紅，王程
(吉林醫(yī)藥學院，吉林吉林 132013)

目的 觀察青蒿素灌胃對順鉑致小鼠急性腎損傷的防治作用。方法 將40只小鼠隨機分為5組，分別為模型組和青蒿素低、中、高劑量組和對照組，各8只。模型組給予生理鹽水灌胃10 d，第5 天單次腹腔注射順鉑10 mg/kg；青蒿素低、中、高劑量組每日給予20、40、80 mg/kg青蒿素灌胃10 d，第5 天單次腹腔注射順鉑10 mg/kg。對照組給予生理鹽水灌胃，連續(xù)10 d。測算各組小鼠腎系數；采用脲酶法檢測各組小鼠血清尿素氮(BUN)水平，肌氨酸氧化酶法檢測肌酐(Cr)水平；采用WST-1法檢測各組小鼠腎組織超氧化物歧化酶(SOD)水平，TBA法檢測丙二醛(MDA)水平，微板法檢測谷胱甘肽(GSH)水平。結果 與對照組相比，模型組小鼠腎系數、血清Cr、血清BUN和腎組織MDA升高(P均<0.01)，腎組織SOD、GSH下降(P均<0.01)。與模型組相比，青蒿素中、高劑量組小鼠腎系數、血清Cr、血清BUN和腎組織MDA降低(P均<0.01)，腎組織SOD、GSH升高(P均<0.01)；與青蒿素中濃度組相比，青蒿素高劑量組小鼠腎系數、血清Cr、血清BUN和腎組織MDA更低(P均<0.01)，腎組織SOD、GSH更高(P均<0.01)。結論 青蒿素灌胃可以改善順鉑致急性腎損傷小鼠腎功能，起到防治小鼠急性腎損傷的作用，且呈一定的劑量-效應關系。這種作用可能是通過青蒿素抑制腎組織氧化應激實現的。

青蒿素；順鉑；腎損傷；腎功能；氧化應激

青蒿素是菊科植物黃花蒿的主要成分，目前青蒿素及其衍生物已作為抗瘧疾藥物在臨床廣泛使用[1]，且其急性不良反應非常低[2]。在青蒿素及其衍生物的臨床應用中發(fā)現，其對重癥瘧疾合并的急性腎損傷有很好的治療效果[3,4]。實驗研究也發(fā)現，青蒿素及其衍生物可以改善大鼠蛋白尿和腎纖維化[5]，同時對狼瘡性腎炎具有治療作用[6]，此外也可改善阿霉素誘導的腎損傷[7,8]。目前研究認為，青蒿素及其衍生物對腎功能的改善作用可能與其抗炎作用有關[9～11]。但近來研究顯示，青蒿素及其衍生物也具有較好的抗氧化作用[12～16]，而這一作用也可能參與了腎功能的改善。順鉑是一類含鉑抗癌藥物，可使DNA交聯而引起細胞凋亡，常用于治療各種類型的實體瘤，但因有較多不良反應而限制了其在臨床的應用，其中腎毒性最為常見。在使用順鉑治療時，如果患者肌酐清除率降低，需要通過減少順鉑的使用劑量來保護腎功能，從而影響抗腫瘤治療效果。順鉑的腎毒性機制包括炎癥、氧化應激等[17]，青蒿素及其衍生物具有抗腫瘤[18]、抗炎[19]、抗氧化等作用，因此在使用順鉑的同時，聯合應用青蒿素或其衍生物，不僅可以保證抗腫瘤的效果，而且可以降低順鉑引起的不良反應。目前對青蒿素及其衍生物的腎功能改善作用的研究集中于抗炎機制方面，其是否能通過抗氧化途徑改善腎功能，尚未見相關報道。本研究采用順鉑誘導急性小鼠腎損傷，觀察青蒿素灌胃對順鉑致小鼠急性腎功能損傷的保護作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥品、主要試劑和儀器 C57BL/6J小鼠40只，雄性，SPF級，35～52日齡，由長春市億斯實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號：SCXK(吉)2011-0004。青蒿素(純度99%)由西安小草植物科技有限公司提供；順鉑購自美國Sigma公司；肌酐(Cr)檢測試劑盒(批號：20160114)、尿素氮(BUN)檢測試劑盒(批號：20160115)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(批號：20160118)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(批號：20160116)和谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒(批號：20160115)均購自南京建成生物工程研究所有限公司；WD-2102A自動酶標儀由北京市六一儀器廠生產。

1.2 實驗分組、模型建立及青蒿素應用方法 將40只小鼠隨機分5組，每組8只。對照組給予生理鹽水灌胃，連續(xù)10 d；模型組給予生理鹽水灌胃10 d，第5 天單次腹腔注射順鉑(10 mg/kg)；青蒿素低、中、高劑量組每日給予20、40、80 mg/kg青蒿素灌胃10d，第5 天單次腹腔注射順鉑(10 mg/kg)。

1.3 各組小鼠腎系數的檢測方法 實驗期間每天觀察小鼠飲食飲水日常活動及體質量變化等情況，第10 d給藥前開始禁食不禁水12 h，末次給藥1 h后，10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉小鼠，腹主動脈采血。處死小鼠后取新鮮腎去包膜稱重，計算腎系數，腎系數 =(腎質量/體質量)×100% 。

1.4 各組小鼠血清BUN、Cr檢測方法 小鼠血液樣本以3 000 r/min離心5 min分離血清，檢測血清Cr和BUN，Cr檢測采用肌氨酸氧化酶法，BUN檢測采用脲酶法，具體操作參照試劑盒說明書進行。

1.5 各組小鼠腎組織SOD、MDA、GSH檢測方法 取各組小鼠新鮮腎組織稱重，按照 1∶9的比例加入生理鹽水，冰浴條件下研磨成10 %的組織勻漿，2 500 r/min 離心10 min，取上清液，測定腎組織勻漿中SOD、MDA和GSH水平，SOD檢測采用WST-1法，MDA檢測采用TBA法，GSH檢測采用微板法，具體操作參照試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 各組小鼠腎系數及血清Cr、BUN比較 實驗完成后各組小鼠腎系數及血清Cr、BUN見表1。由表1可見，腎系數及血清Cr、BUN水平模型組高于對照組，青蒿素中、高劑量組低于模型組，且青蒿素高劑量組低于青蒿素中劑量組(P均<0.01)；青蒿素低劑量組小鼠腎系數及血清Cr、BUN水平與模型組相比，P均>0.05。

表1 各組小鼠腎系數及血清Cr、BUN水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

2.2 各組小鼠腎組織SOD、MDA及GSH比較 各組小鼠腎組織SOD、MDA及GSH見表2。由表2可見與對照組比較，模型組小鼠腎組織SOD、GSH下降，MDA升高(P均<0.01)；與模型組比較，青蒿素中、高劑量組小鼠腎組織SOD、GSH升高，MDA降低(P均<0.01)；青蒿素高劑量組腎組織SOD、GSH高于青蒿素中劑量組(P<0.01)，腎組織MDA低于青蒿素中劑量組(P<0.01)；青蒿素低劑量組小鼠腎組織SOD、MDA及GSH水平與模型組相比，P均>0.05。

表2 各組小鼠腎組織SOD、MDA、GSH水平比較

注： 對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

3 討論

順鉑對細胞的損傷作用造成線粒體呼吸鏈破壞，大量自由基以活性氧簇(ROS)形式從線粒體中釋放，同時細胞SOD和GSH減少[20，21]、谷胱甘肽還原酶活性降低[22]等都進一步導致細胞的損傷和死亡，形成惡性循環(huán)。對順鉑誘導的大鼠腎損傷模型的各種氧化應激標志物檢測發(fā)現，NO、MDA水平升高以及SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等活性的降低都與順鉑導致的急性腎損傷相關，相反一些抗氧化劑可以改善腎的氧化應激狀態(tài)[23]。

本研究結果顯示，與對照組相比，模型組小鼠腎系數及血清Cr、BUN水平升高，符合急性腎損傷表現。與對照組相比，模型組小鼠腎系數明顯上升，表明順鉑在體內積聚，對腎組織和細胞造成直接或間接的破壞，引發(fā)炎性細胞浸潤及腎組織水腫；與模型組相比，青蒿素中劑量組和高劑量組腎系數明顯下降，這表明青蒿素能夠改善腎組織的損傷和炎癥浸潤狀態(tài)。腎組織中SOD、MDA和GSH水平可反映順鉑應用后誘導的腎氧化和抗氧化狀態(tài)。本研究結果顯示模型組小鼠腎組織GSH和SOD水平下降，MDA水平升高，說明順鉑可以造成腎組織的氧化和抗氧化狀態(tài)的改變，抗氧化酶水平下降，而脂質過氧化物水平升高。與模型組相比，青蒿素中、高劑量組的GSH水平和SOD活性都明顯升高，而這兩個劑量組的MDA水平均明顯下降。因此本研究結果提示，以青蒿素作為急性腎損傷的保護劑可改善氧自由基代謝和體內抗氧化水平，青蒿素可以直接或間接拮抗自由基的產生，促進其清除，并可保護抗氧化酶的活性。

但目前認為青蒿素在氧化和抗氧化兩方面都發(fā)揮作用。青蒿素作為一種含內過氧化基團(過氧橋)的倍半萜內酯類化合物，能穿過細胞膜進入細胞內，通過過氧橋的斷裂，產生大量自由基，并形成強烷化劑，攻擊細胞膜性結構，甚至直接氧化蛋白質分子而誘發(fā)氧化應激反應，導致細胞死亡。而且在眾多的青蒿素抗腫瘤研究中都表明，青蒿素能通過提高ROS水平，抑制腫瘤細胞生長。而另外一些研究卻得出相反的結論，在青蒿素衍生物青蒿琥酯改善吸煙誘導的急性肺損傷的研究中，青蒿琥酯可以降低小鼠肺泡灌洗液中8-異前列腺素、8-羥化脫氧鳥苷(8-OHdG)、3-硝基酪氨酸等氧化損傷標志物的水平，同時提高肺組織中抗氧化過氧化物酶的活性，降低NADPH氧化酶-2蛋白表達水平[14]，這與另一項青蒿琥酯改善過敏性哮喘的研究結果相似[15]。另有研究表明，蒿甲醚可以增加宿主的酶和非酶的抗氧化物水平[16]。目前雖然青蒿素及其衍生物已經在臨床廣泛使用，但其抗瘧原蟲感染機制研究仍不全面，其抗腫瘤研究也多集中于體外實驗方面，對其在自身免疫性疾病改善作用方面的研究也主要涉及抗炎機制，而其誘導的氧化應激和抗氧化機制等仍需要進一步深入研究。

[1] Wang W, Liang YS. Artemisinin: A wonder drug from Chinese natural medicines[J]. Chin J Nat Med, 2016,14(1):5-6.

[2] Li Q, Xie LH, Johnson TO, et al. Toxicity evaluation of artesunate and artelinate in Plasmodium berghei-infected and uninfected rats[J]. Trans R Soc Trop Med Hyg, 2007,101(2):104-112.

[3] Plewes K, Haider MS, Kingston HW, et al. Severe falciparum malaria treated with artesunate complicated by delayed onset haemolysis and acute kidney injury[J]. Malar J, 2015,14:246.

[4] Thaha M, Pranawa, Yogiantoro M, et al. Acute renal failure in a patient with severe malaria and dengue shock syndrome[J]. Clin Nephrol, 2008,70(5):427-430.

[5] Li TT, Zhang XH, Jing JF, et al. Artemisinin analogue SM934 ameliorates the proteinuria and renal fibrosis in rat experimental membranous nephropathy[J]. Acta Pharmacol Sin, 2015,36(2):188-199.

[6] Wu X, Zhang W, Shi X, et al. Therapeutic effect of artemisinin on lupus nephritis mice and its mechanisms[J]. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2010,42(12):916-923.

[7] Wu X, An P, Ye B, et al. Artemisinin ameliorated proteinuria in rats with adriamycin-induced nephropathy through regulating nephrin and podocin expressions[J]. J Tradit Chin Med, 2014,34(1):63-68.

[8] Razavi A, Nouri HR, Mehrabian F, et al. Treatment of experimental nephrotic syndrome with artesunate[J]. Int J Toxicol, 2007,26(4):373-380.

[9] 米緒華，欒森，馬行一，等．青蒿琥酯對IgA腎病模型大鼠腎組織MCP-1及其mRNA表達的影響[J]．四川大學學報(醫(yī)學版)，2009，40(5)：821-825．

[10] 董妍君，李衛(wèi)東，屠呦呦，等．雙氫青蒿素對BXSB狼瘡小鼠自身抗體產生、TNFα分泌及狼瘡性腎炎病理改變的影響[J]．中國中西醫(yī)結合雜志，2003，23(9)：676-679．

[11] Lu L. Study on effect of Cordyceps sinensis and artemisinin in preventing recurrence of lupus nephritis[J]. Chin J Med Surg, 2002,22(3):169-171.

[12] Kim MH, Seo JY, Liu KH, et al. Protective effect of Artemisia annua L. extract against galactose-induced oxidative stress in mice[J]. PLoS One, 2014,9(7):e101486.

[13] Skowyra M, Gallego MG, Segovia F, et al. Antioxidant Properties of Artemisia annua Extracts in Model Food Emulsions[J]. Antioxidants (Basel), 2014,3(1):116-128.

[14] Ng DS, Liao W, Tan WS, et al. Anti-malarial drug artesunate protects against cigarette smoke-induced lung injury in mice[J]. Phytomedicine, 2014,21(12):1638-1644.

[15] Nneji CM, Adaramoye OA, Falade CO, et al. Effect of chloroquine, methylene blue and artemether on red cell and hepatic antioxidant defence system in mice infected with Plasmodium yoelii nigeriensis[J]. Parasitol Res, 2013,112(7):2619-2625.

[16] Ho WE, Cheng C, Peh HY, et al. Anti-malarial drug artesunate ameliorates oxidative lung damage in experimental allergic asthma[J]. Free Radic Biol Med, 2012,53(3):498-507.

[17] Ozkok A, Edelstein CL. Pathophysiology of cisplatin-induced acute kidney injury[J]. Biomed Res Int, 2014,2014:967826.

[18] Ooko E, Saeed ME, Kadioglu O, et al. Artemisinin derivatives induce iron-dependent cell death (ferroptosis) in tumor cells[J]. Phytomedicine, 2015,22(11):1045-1054.

[19] Cao Q, Jiang Y, Shi J, et al. Artemisinin inhibits the proliferation, migration, and inflammatory reaction induced by tumor necrosis factor-α in vascular smooth muscle cells through nuclear factor kappa B pathway[J]. J Surg Res, 2015,194(2):667-678.

[20] Tanabe K, Tamura Y, Lanaspa MA, et al Epicatechin limits renal injury by mitochondrial protection in cisplatin nephropathy[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2012,303(9):F1264-1274.

[21] Kharbangar A, Khynriam D, Prasad SB. Effect of cisplatin on mitochondrial protein, glutathione, and succinate dehydrogenase in Dalton lymphoma-bearing mice[J]. Cell Biol Toxicol, 2000,16(6):363-373.

[22] Kruidering M, Van de Water B, de Heer E, et al. Cisplatin-induced nephrotoxicity in porcine proximal tubular cells: mitochondrial dysfunction by inhibition of complexes I to IV of the respiratory chain[J]. J Pharmacol Exp Ther, 1997,280(2):638-649.

[23] Akyol S, Ugurcu V, Altuntas A, et al. Caffeic acid phenethyl ester as a protective agent against nephrotoxicity and/or oxidative kidney damage: a detailed systematic review[J]. Scien WorldJ, 2014,2014:561971.

·作者·編者·讀者·

《山東醫(yī)藥》對縮略語的使用要求

文題原則上不能使用縮略語，文中應盡量少用縮略語。公認的縮略語在文中可以直接使用。未公認的名詞術語，請按照以下規(guī)則進行縮寫：原詞過長且在文內多次出現者，若為中文可于第一次出現時寫出全稱，在括號內寫出縮略語，如金黃色葡萄球菌(金葡菌)；若為外文縮略語可于第一次出現時寫出中文全稱，在括號內寫出縮略語，如：臨床隨機對照試驗(RCT)。不超過4個漢字的名詞不宜使用縮略語，以免影響文章的可讀性。以下名詞術語可直接使用縮寫。

胎牛血清(FBS) 腺苷三磷酸(ATP) 天冬氨酸轉氨酶(AST)

丙氨酸轉氨酶(ALT) 人類免疫缺陷病毒(HIV) 獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)

甲型肝炎病毒(HAV) 乙型肝炎病毒(HBV) 丙型肝炎病毒(HCV)

甘油三酯(TG) 總膽固醇(TC) 低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)

高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C) 核因子-κB(NF-κB) 磷酸鹽緩沖液(PBS)

腫瘤壞死因子(TNF) 干擾素(IFN) 一氧化氮(NO)

白細胞介素(IL) 輔助性T淋巴細胞(Th) 精制結核菌素試驗(PPD)

自然殺傷細胞(NK細胞) 人類白細胞抗原(HLA) 乳酸脫氫酶(LDH)

信使RNA(mRNA) 血紅蛋白(Hb) 紅細胞(RBC)

白細胞(WBC) 血小板(PLT) C反應蛋白(CRP)

彌漫性血管內凝血(DIC) 凝血酶時間(TT) 活化部分凝血活酶時間(APTT)

纖溶酶原激活物抑制物(PAI) 凝血酶原時間(PT) 纖維蛋白降解產物(FDP)

嚴重急性呼吸綜合征(SARS) 動脈血氧分壓(PaO2) 動脈血二氧化碳分壓(PaCO2)

紅細胞沉降率(ESR) 變異系數(CV) Glasgow昏迷評分(GCS)

Glasgow預后評分(GOS) 體質量指數(BMI) 世界衛(wèi)生組織(WHO)

磁共振成像(MRI) T1加權成像(T1WI) T2加權成像(T2WI)

磁共振彌散張量成像(DTI) 磁共振彌散加權成像(DWI) 數字減影血管造影(DSA)

電子計算機體層掃描(CT) 正電子發(fā)射斷層掃描(PET) 單光子發(fā)射計算機斷層掃描(SPECT)

聚合酶鏈反應(PCR) 酶聯免疫吸附測定(ELISA) 實時定量聚合酶鏈反應(real-time PCR)

逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR) 重癥監(jiān)護病房(ICU) 蘇木素-伊紅(HE)

甲型病毒性肝炎(甲肝) 乙型病毒性肝炎(乙肝) 丙型病毒性肝炎(丙肝)

丁型病毒性肝炎(丁肝) 光學顯微鏡(光鏡) 電子顯微鏡(電鏡)

免疫組織化學(免疫組化) 化學藥物治療(化療) 放射治療(放療)

活體組織檢查(活檢)

吉林省科技廳自然科學基金項目(20150101131JC)；吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目(吉教合字2015-405)；吉林省衛(wèi)生廳科技計劃基金資助項目(2013ZC015)。

王程(E-mail：wangcheng10@mails.jlu.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.11.011

R473

A

1002-266X(2017)11-0036-04

2016-09-22)