高壓氧聯合仙桃草飼喂治療兔骨缺損效果觀察

席立成，李宏宇，趙子星，郁少林，劉搏宇(廣西壯族自治區人民醫院，南寧 530021)

高壓氧聯合仙桃草飼喂治療兔骨缺損效果觀察

席立成，李宏宇，趙子星，郁少林，劉搏宇
(廣西壯族自治區人民醫院，南寧 530021)

目的 觀察用高壓氧聯合仙桃草飼喂治療兔骨缺損的效果。 方法 選用新西蘭大白兔80只制作兔骨缺損模型，隨機分為A、B、C、D組，A組給予高壓氧聯合仙桃草飼喂治療、B組給予高壓氧治療、C組給予仙桃草飼喂治療，D組為正常對照不用藥。分別于治療后第2、4、8、12周分批處死各組兔，在電鏡、光鏡下計數新生骨痂成骨細胞數及新生骨小梁面積比，電鏡下觀察成骨細胞和骨股原纖維形態。 結果 光鏡下治療后2、4、8、12周A組兔骨痂新生骨小梁鏡下面積比和成骨細胞計數高于B、C、D組(P均<0.05)，B、C組兔骨痂新生骨小梁鏡下面積比和成骨細胞計數高于D組(P均<0.05)。電鏡下觀察，與B、C、D組比較，A組成骨細胞細胞器最發達，骨膠原纖維排列整齊, 分布均勻。 結論 高壓氧聯合仙桃草飼喂治療兔骨缺損，可明顯增強成骨細胞增殖分化及成骨能力,加快骨小梁生成，促進骨缺損的愈合，效果強于單用高壓氧或者仙桃草者。

高壓氧；仙桃草；骨缺損；成骨細胞；骨小梁；動物實驗

目前臨床上常用的骨缺損治療方法主要有自體骨移植、同種異體骨移植、人工骨移植等，但均存在不足。尋找一種有效的常規保守治療骨缺損的方法非常重要。高壓氧能促進骨折愈合，縮短骨折愈合時間。仙桃草又名接骨草，中醫認為仙桃草有“接骨”功效。本研究用高壓氧聯合仙桃草飼喂治療兔骨缺損，觀察模型兔新生骨痂中骨小梁和成骨細胞生長情況。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選用標準實驗新西蘭大白兔80只，體質量3.0～3.5 kg，兔齡5～6個月，雌雄不拘。動物高壓氧艙(型號03-Y900-001，中國煙臺)，光學顯微鏡(型號Olympus BX40，日本)，電子顯微鏡(型號日立H-7650，日本)，電子天平，解剖工具。

1.2 兔骨缺損模型制作、分組及治療方法 采用文獻方法于兔左橈骨中段制作長約1.5 cm骨缺損，切除骨膜，縫合包扎。術后3 d內每日注射硫酸慶大霉素注射液1次，16萬U/次。均造模成功。隨機分為A、B、C、D組，各20只。A組予高壓氧聯合仙桃草飼喂治療；B組予高壓氧治療；C組行仙桃草飼喂治療；D組為對照組。高壓氧治療壓力0.25 MPa (2.5 個大氣壓)，加壓時間25～30 min，穩壓時間60～70 min，減壓時間31～35 min，1次/d，9次為1個療程。每個療程后休息2～3 d，然后繼續治療4個療程。A、C組兔從造模后第1天起每日每只兔給含仙桃草精飼料65 g，含生藥1.2 g；C、D組給等量精飼料。治療后第2、4、8、12周各組分批處死5只兔。取出骨缺損間隙的骨痂進行后續實驗。

1.3 各組兔骨痂新生骨小梁鏡下面積比測算方法 將骨痂置入10%甲醛中固定24 h，依次行EDTA脫鈣，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，HE染色，4 μm連續切片，封片后光學顯微鏡下組織學觀察。新生骨小梁鏡下面積比檢測采用Lane-Sandhu骨移植物組織學評分法。選取每個標本中無明顯組織分離、相同深度的 5 張切片進行骨形態計量分析，在放大100 倍條件下，每張切片上隨機選取 5 個視野，測定兩組各時間點新生骨小梁面積占鏡下修復區面積的比值(新生骨小梁鏡下面積比)。

1.4 各組兔骨痂成骨細胞計數方法 將骨痂用多聚甲醛固定，EDTA 脫鈣，常規脫水，石蠟浸潤包埋，4 μm 厚連續切片，采用免疫組化法進行堿性磷酸酶(ALP)染色，成骨細胞胞質藍染，在低倍鏡下找到骨小梁位置，然后換成40倍鏡，依照上下、左右的順序，選取5個骨小梁區域進行成骨細胞計數。

1.5 各組兔電鏡下成骨細胞和骨膠原纖維形態觀察方法 截取1 mm×2 mm大小的骨痂標本，投入4 ℃的3%戊二醛、1.5%多聚甲醛液固定后，用5.5%EDTA、1%戊二醛、二甲胂酸鈉液(pH值7.2)4 ℃脫鈣，漂洗后用1%四氧化鋨固定，再漂洗后逐級脫水，環氧樹脂包埋。經半薄切片定位，超薄切片70 nm，染色后電子顯微鏡下觀察成骨細胞和骨膠原纖維形態。

2 結果

2.1 各組兔骨痂新生骨小梁鏡下面積比比較 治療后各組兔骨痂新生骨小梁鏡下面積比逐漸升高。治療后第2周時，A組骨小梁排列不規則，數量不多，B、C組骨小梁量更少，D組骨小梁少，且密度稀疏、體積細小；第4周時，A組骨小梁周圍大量成骨細胞圍繞，骨小梁體積粗大，部分連接成網絡，B、C組骨小梁數量較多，但未見鏈接成網絡，骨小梁周圍較多成骨細胞，D組骨小梁增多，排列不規則；第8及12周時，A組骨小梁全成網絡狀，B、C組骨小梁部分成網絡狀，D組骨小梁排列欠規則。各時點各組兔骨痂新生骨小梁鏡下面積比見表1。治療后2、4、8、12周A組兔骨痂新生骨小梁鏡下面積比高于B、C、D組(P均<0.05)，B、C組兔骨痂新生骨小梁鏡下面積比高于D組(P均<0.05)。

表1 各時點各組兔骨痂新生骨小梁鏡下面積比比較±s)

注：與B組相比，*P<0.05；與C組相比，#P<0.05；與D組相比，▲P<0.05。

2.2 各組兔骨痂成骨細胞計數比較 治療后各組兔骨痂成骨細胞計數逐漸升高，至治療后8周達到高峰，然后下降。治療后2、4、8、12周各組兔骨痂成骨細胞計數見表2。

表2 各時點各組兔骨痂成骨細胞計數比較±s)

注：與B組相比，*P<0.05；與C組相比，#P<0.05；與D組相比，▲P<0.05。

2.3 各組兔骨痂電鏡下成骨細胞及骨膠原纖維形態 電鏡下觀察，第2周時A組成骨細胞較其他三組明顯多，并可見排列紊亂的骨膠原纖維，B、C組膠原纖維少，成骨細胞數量和體積均小，D組骨膠原纖維細小且連續性差。第4周時，A組成骨細胞體積較大，內質網及線粒體較多，膠原纖維膠致密，分布均勻，B、C組成骨細胞體積相對小，內質網及線粒體不發達，骨膠原纖維排列較亂，D組成骨細胞內內質網及線粒體少見，膠原纖維粗細不一。第8周及12周時，A、B、C三組可見膠原纖維與骨小梁并行排列，可見周期性橫紋，且A組成骨細胞及細胞核體積大，核膜完整；B、C組細胞器較A組欠豐富，D組膠原纖維較多，直徑較粗。

3 討論

成骨細胞分泌骨基質，并參與骨基質及骨鈣的代謝，其增殖能產生豐富的膠原，是骨形成過程中的主要功能細胞[1]。骨小梁的結構和骨強度密切相關，骨小梁的生成量與排列結構是判斷骨折愈合與否的重要參考指標。研究表明[2]，骨小梁的微觀結構決定骨強度。本研究觀察了模型兔骨缺損區新生骨痂成骨細胞數量、微觀結構及骨小梁的體積、排列，上述指標可以很好的反映缺損區骨組織的新生能力以及骨折愈合情況。

高壓氧治療是指在比大氣壓高的氣壓環境下吸入純氧，增加血液中的溶解氧量，進而改善癥狀和治療疾病。高壓氧治療骨缺損的主要機制有：①高壓氧通過增加血氧含量，改善骨折端組織的缺氧狀態。②高壓氧治療能促進新生毛細血管的生成，降低全血黏度及血漿黏度，增加缺損區血液供應，從而促進骨組織的生長[3]。③高壓氧還可以通過增強成骨細胞和破骨細胞的增殖、分裂，加速骨膜下骨樣組織的生長從而促進骨再生[4]。④此外，高壓氧還可以通過誘導骨髓間充質細胞分化來治療骨缺損[4]。

仙桃草又名接骨草。是一種廣泛應用于骨科領域的中草藥，其主要有效成份包括木犀草素、金圣草素、原兒茶酸、香草酸、甘露醇、綠原酸等[5,6]。木犀草素對抗氧自由基的活性與表達，能明顯促進血管內皮損傷的修復，在骨組織修復過程中可能起著重要作用[7，8]。香草酸及其受體對骨代謝及成骨細胞分泌骨保護蛋白中起著重要的調控作用[9,10]。原兒茶酸不僅具有較強的抗氧化功能，而且能促進人脂肪干細胞體外增殖分化為成骨細胞[11]。

本研究發現，高壓氧聯合仙桃草飼喂治療兔骨缺損，與單用高壓氧和仙桃草飼喂者相比，新生骨痂成骨細胞計數高，骨小梁生長快。高壓氧能促進新生毛細血管的生成，但新生毛細血管內皮細胞發育并不成熟，細胞通透性高，液體滲出較多，可影響和壓迫局部的血運和抑制骨細胞生長，而仙桃草中的主要成分之一木犀草素不僅能緩解高壓引起的血運障礙，而且能促進血管的成熟。此外，仙桃草中還含有一定含量的甘露醇[5,6]，甘露醇具有明顯的脫水作用，可減輕高壓氧治療所引起新生毛細血管周圍的高滲高壓狀態，減輕水腫對血管的壓力，從而改善微循環血流量。研究[12]發現，仙桃草中的原兒茶酸分子結構中的鄰二酚羥基為體外清除自由基的活性部位，同時有羧基時能明顯增強促血管新生的活性，而高壓氧可通過提高血氧含量，促進原兒茶酸分子羥基向羧基的轉化。因此，仙桃草飼喂除了本身的藥物治療作用以外，還能彌補高壓氧治療時所存在的不足。另外高壓氧能提高組織內氧含量，增強細胞活性，因而有利于仙桃草中的有效成分進入細胞內并在胞內發揮效應。此外，高壓氧可以降低由激素引起的全血粘度及血漿黏度，使血流通暢，這將有利于仙桃草中的有效成分迅速到達骨缺損部位，從而使藥物發揮其最大作用。其具體機制有待進一步證實。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.11.012

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