鎖核酸在抗病毒基因診斷與治療中的應用新進展

肖樹榮　鄧益斌

基因是現代研究的一個新領域和新熱點，PCR技術因準確度和特異性高、靈敏度好等優點受到了醫學工作者的青睞。PCR技術能在早期及時發現疾病，做到早預防和早治療。而基因治療中的反義寡核苷酸治療和核酶是從分子水平對疾病進行干預和治療，具有從源頭治療的優點。但天然的寡核苷酸穩定性差，容易被各種核酶迅速降解，給研究應用帶了一大難題。因此需尋找一種物質對寡核苷酸進行修飾，增加其抗酶切能力和提高其穩定性。近年來，鎖核酸因其具有穩定性好、分子雜交能力強、抗核酸酶降解能力高、脂溶性好和低細胞毒性等特點而被人們應用于基因診斷和基因治療。筆者就鎖核酸的理化性質、基因診斷與治療中的應用新進展作一綜述，以期為其在病毒診斷、治療中的應用提供潛在的研究價值。

1.鎖核酸的化學結構與理化性質

1.1化學結構 鎖核酸（10cked nucleic acid，LNA）也稱橋核酸，是一種化學結構較特殊的雙環狀核苷酸衍生物，其分子結構中含有一個或多個2-0.4-C-亞甲基-B-D-呋喃核糖核酸單體，核糖的2-0位和4-C位通過不同的縮水作用形成氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋，并連接成環形，形似鎖狀或橋狀，這個環形橋鎖定了呋喃糖C3-內型的N構型，降低了核糖結構的柔韌性，增加了磷酸鹽骨架的局部結構的穩定性。LNA的特殊構象能夠導致核酸骨干的預組裝，在某種程度上增加堿基堆積力，有利于雙鏈形成。

1.2理化性質 由于LNA化學結構的特殊構象，其理化性質比其他寡核苷酸具有更突出的優勢：①提高與補序列的雜交高親和性：因為LNA堿基與DNA、RNA的磷酸鹽骨架相同，LNA堿基與互補序列雜交時不但具有更高親和力，而且這種相同的磷酸鹽骨架能使互補序列被LNA容易識別，從而形成高親和力的雜交物。②增加互補雙鏈的熱穩定性：LNA單體增加到寡核苷酸鏈中時，其解鏈溫度（Tm）可明顯提高，在LNA與DNA形成的雜交雙鏈中，Tm可提高2℃-6℃，在LNA與RNA形成的雜交雙鏈中，Tm可提高3℃-9℃，可見與互補雙鏈的熱穩定性明顯增加。③改善抗核酸酶切割能力：血液中siRNA不穩定，極易被大量的核糖核酸酶迅速分解，在siRNA 3末端被LNA單體修飾后，siRNA抗核酸酶切割能力和在血清中的半衰期明顯提高。④LNA的無毒性：注射反義LNA后，通過檢測小鼠血清肝腎功能生化指標和病理切片HE染色，未發現有明顯變化。⑤LNA與DNA或RNA結合時，錯配辨別力更強。⑥LNA水溶性好，自由出人細胞，易被機體吸收。正是因為LNA所具有的這些優勢，近年來不管是在基因診斷還是基因治療中，LNA成了學者的研究熱點。

2.LNA在抗病毒診斷中的應用

2.1乙型肝炎病毒（HBV）檢測 在治療慢性乙型肝炎時，核苷類似物如拉米夫定（LAM）、替比夫定、阿德福韋（ADV）等被長期應用于抗乙肝病毒（Hepatitis B Virus.HBV）治療并一定程度上抑制了病毒的復制。但是長期使用這些抗病毒藥物可使病毒基因發生變異，產生耐藥，最終引起無效治療和影響后期的康復。因此，測定先存或新形成的HBV抵抗菌株在臨床治療中對抗病毒治療方法選擇有著重要意義。目前檢測耐藥HBV一般由直接測序法完成，但是這種方法耗時，更重要的是無法同時檢測混在同一樣品中野生型和變異型的種群，因此不適合常規的臨床應用。普通PCR擴增病毒DNA的種群測序法敏感性較低，當新形成的變異株數量較少或是中止治療后變異株降低時難以鑒別。其他的方法比如線性探針分析法，敏感性雖然比普通PCR擴增病毒DNA的種群測序法增加5%-10%，但是變異株的數量常常在它的檢測最低水平以下。建立一種靈敏、特異、準確、快速、方便的檢測方法對于慢性乙型肝炎感染者抗病毒治療中耐藥性的確定和監測具有重要意義。有研究者構建聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）與Real-time PCR-LNA-TaqMan探針.并用這兩種方法與直接測序法檢測拉米夫定藥物治療的乙肝患者血清HBV，實驗結果顯示，PCR-RFLP與Real-time PCR-LNA-TaqMan探針法可以檢測野生型YMDD和它的變異型YIDD和YVDD，但Real-time PCR-LNA-TaqMan探針法鑒定耗時少，更敏感。Wang Q等用同樣的方法檢測15例單純HBsAg（+）樣本，結果有4例HBsAg（+）樣本未能被普通TaqMan探針檢測出陽性，而使用LNA-TaqMan探針法檢測全為陽性。Sun z等建立TaqMan-LNA探針多重實時PCR（multiplex realtime PCR）方法鑒別野生型和突變型菌株。研究發現這種靈敏的方法可以定量10拷貝的HBV，能檢測10拷貝野生型HBV中存在低至1%的突變型，而且分析30例HbsAg（+）血清樣品只需要3.5小時。用等位基因特異性鎖核酸實時熒光定量PCR（RT-AS-LNA-q PCR）方法.通過序列匹配標準對變異型和野生型HBV定量，實驗中能準確檢測占總菌數水平0.1%或以下的17種不同的核苷酸變異且進行基因分型。Zeng Y等用同樣的方法檢測野生型、突變型標準質粒時，證實了該方法線性范圍寬和檢測下限低，而且準確度高。

2.2丙型肝炎病毒（HCV）檢測 HCV病毒載量的測定是慢性丙型肝炎治療管理必不可少的一部分。常用的血清和血漿的HCV RNA定量非常耗時且試劑用量大，另外，一些存留在細胞內如外周單個核細胞（PBMC）、冷沉淀劑、吸附在紅細胞或血小板的病毒RNA無法檢測。因此，定量血清或血漿HCVRNA往往低于總的循環病毒載量。雖然檢測存留在PBMC和全血的HCV RNA可為干擾素治療結束后預測病毒復發，然而定量分析PBMC病毒動力學只能提供微小的預測信息，而且PBMC分離、計數、洗滌程序也較為煩瑣，因此，或許全血定量HCVRNA可以作為最佳選擇。但是，尚未有研究證實是否用全血定量HCV RNA比血漿或者血清具有更高的診斷敏感性。Bruns T構建LNA合成的核苷酸衍生物2-0-甲基RNA（2-ome-RNA）形成穩定的復合物而更能抵抗核酸酶的降解，因此LNA修飾的寡核苷酸能提高RNA的提取率。從222份臨床血漿樣本，82份用LNA介導的捕獲方法提取HCV RNA，實時反轉錄PCR（real-time reverse transcription-PCR）定量，結果與試劑盒H AmpliPrep/TaqMan（CAP/CTM）HCV測試比較，這個實驗的分析敏感性為9IU/10微升樣品，線性范圍為500-5×10 IU/ml，在血漿準確測試10個HCV亞型：血漿和全血樣品檢測結果是相等的（決定系數R2=0.943）和在全血中特異性為100%（n=20）；敏感性在血漿濃度為95%檢測極限時全血樣品為100%（n=141）；10微升全血定量結果與HCV血漿測試結果具有相關線性（R2=0.919；n=140）。目前檢測人類肝組織HCV的方法主要有免疫組織化學、原位雜交（ISH）、原位RT-PCR，但是免疫組織化學和ISH重復性較差，原位RT-PCR雖然敏感性好，但伴隨著較高的假陽性率。為了尋找可靠診斷的組織化學技術檢測肝組織HCV，設計LNA探針ISH技術和生物素釋放信號擴增系統（biotin-free catalyzed signal amplification sys-tern，CSAII）檢測中嵌合體小鼠和丙肝患者肝組織HCV RNA，結果顯示陽性率分別為100%（13/13）和82%（9/11），在慢性乙肝損傷、脂肪肝、自身免疫性肝炎、原發性肝癌中HCV RNA均是陰性。證明了LNA探針ISH技術簡單可靠，適用于常規細針活檢檢測丙肝患者肝臟中HCV RNA。

2.3HIV檢測 精確檢測血液中HIV DNA和RNA，無論診斷是否HIV感染，還是評估HIV病人治療后病毒載量、病毒復制的治療效果都起到重要作用。但在廣泛使用抗病毒治療的環境下，HIV-1由于基因變異產生了藥物抵抗，但其機制非常復雜.當產生藥物抵抗時需要改變治療方案。HIV的單核苷酸基因多態性（single-nucleotide polymorphism，SNP）給各種傳統的檢測方法檢測提出了難題，一方面HIV-1 M組HIV-1亞型遺傳多樣性，無法與多種變異型特異性結合，目前大多數的熒光定量PCR只適合定量HIV-1 B亞型；另一方面為使探針退火溫度達到最佳，傳統的Taqman探針包括25至35個核苷酸。由于HIV-1自然的異質性，很難在200個堿基對中找到三個保守區（兩個為引物一個為內部探針同源序列）包括所有或大部分HIV-1 M組亞型，這造成了檢測時靈敏性降低。因此需要一種靈敏、高效的實驗方法監測HIV-1型的治療。許多學者在各種方法的基礎上用LNA修飾改良而使檢測的敏感性和特異性上升。因為構建的LNA Taqman探針比普通的Taqman探針更短，與HIV-1亞型保守序列雜交的靶標也相應變短.可以有效克服傳統探針的局限性，應用于HIV-1分型中有更寬的檢測范圍、更靈敏檢測下限，可廣泛適用于HIV-1的分型。在陽性干血斑（dfled blood spots，DBS）中，HIV-1 DNA檢測靈敏度也達到了100%，結果與血漿的HIV RNA水平顯著相關（r=0.765，P<0.0001）。Irina Kira Astakhova等設計熒光寡核苷酸探針標記新型（苯乙炔基）芘染料并附著于LNA，能有效檢測接受抗HIV治療病人的200例臨床樣本野生型核苷酸中的SNP，這種雙探針和雙標記探針對目標DNA/RNA單堿基錯配具有高雜交親和力和出色的熒光反應。T.santhosh Kumar團隊設計了以芘-茈FReT附著于短LNA/DNA探針為基礎的單鏈DNA和RNA，快速、準確分型高度多態性的HIV pol cDNA和RNA片段。Kaori Sugizak等構建激子控制雜交敏感的熒光寡核苷酸（Exciton-controlled hvbridization-sensirive fluorescent oligonucleotide，ECHO）-LNA探針.雜交于靶RNA鏈時達到高的熱穩定性，展現了熒光有效開關轉換性能和促進TAR RNA鏈形成發夾結構的熒光檢測并在PLAC4（placenta-specific 4）RNA序列中能區分一個堿基的不同。

3.LNA在抗病毒基因治療中的應用

3.1HBV基因治療 HBV是一種有包膜的嗜肝DNA病毒，目前HBV可被分為A-J共10種基因型，每種基因型又可進一步分為若干個基因亞型。流行于我國的HBV基因型主要為B和C基因型，其中，B型又以B2亞型為主，主要流行于廣西、廣東、海南等南方地區：C型主要有C1和C2兩種亞型，主要流行于我國北方地區。乙肝病毒感染可引起病毒性乙型肝炎，是一種傳染性較強的疾病，如果得不到有效控制，易發展為肝硬化甚至肝癌，對人類的危害已經成為全球性問題，而中國是重災區之一。目前臨床上治療慢性乙型肝炎仍然缺乏特效藥物，主要應用核苷酸類似物或干擾素等藥物抗病毒治療。這種抗病毒療法雖然在一定程度上能降低人體內的病毒載量，但無法完全清除，因此需探索一種更有效的策略治療乙肝病毒引起的乙型肝炎。基因治療是近年來的研究新熱點，其中反義LNA做了大量的研究并取得了一定的成果。反義LNA治療，其作用原理是通過與特定的病毒mRNA結合，發揮基因“封條”或酶切割作用，使靶mRNA表達受抑制或降解，從而達到治療目的。LNA起到了增加反義寡核苷酸的熱穩定性和親和力作用。在體外細胞實驗中利用拉米夫定抗病毒藥物與HBV S基因反義LNA對比抗病毒效果，研究發現，拉米夫定對HBV DNA抑制效果明顯，但對HBsAg、HBeAg抑制較弱，而反義LNA對這三個檢測指標都有明顯的抑制作用，效果比拉米夫定更好。鄧益斌等在細胞實驗中設計反義LNA研究其在細胞的抗病毒效果，實驗證明了對HBV DNA、HBsAg、HBeAg有強的抑制作用，且對細胞的新陳代謝無明顯影響。在體外細胞實驗中，反義LNA對HBV的復制和表達表現出了強抑制作用。在進一步的研究中針對HBV S、前C/C、S/C靶點設計反義LNA，并在轉基因小鼠體內驗證對HBV抑制其表達，結果發現，和細胞實驗一樣對HBV有明顯的抑制作用，通過實驗檢測小鼠血清肝功能和腎功能指標及肝、腎組織結構病理檢查，與對照組相比，鎖核酸治療組的肝功能和腎功能無明顯差異，表明了鎖核酸在體內的無毒性和安全性。單靶區和雙靶區對HBV都有較強的抑制作用，但雙靶區抑制效果明顯高于單靶區，證實了聯合多位點設計的反義LNA能更有效抑制HBV。這些研究都證明了HBV的反義治療是有效的，不過由于反義治療的作用位點是mRNA，雖然一定程度上能抑制HBV的生成，但是并沒有從源頭抑制HBV DNA，其可以不斷地表達。因此提出抑制HBV DNA的反基因治療可能獲得更大的抑制效果。反基因治療是由外源特定寡聚脫氧核苷酸與病毒雙鏈DNA的特定區域專一性結合，形成三鏈DNA分子，從而阻斷靶基因的復制與轉錄，實現“反基因”之目的。在國內對反基因LNA治療HBV有了初步研究.Y.-B.Deng等針對乙肝病毒S基因同聚嘌呤區設計反基因鎖核酸細胞實驗，研究對HBV的抑制和表達，實驗結果表明，該實驗對HBV具有明顯的抑制能力。Sun z等在實驗中證明了通過脂質體介導的反基因LNA能有效地穿過細胞核與靶HBV DNA發生特異結合而抑制其復制表達，抑制能力比反義LNA與pgRNA的抑制作用更強，顯示出了反基因具有更強大的抑制能力和發展空間。但是目前的研究只是在細胞實驗中進行，是否在體內一樣具有抑制作用和安全性有待進一步的研究。

3.2HCV基因治療 丙型肝炎是HCV引起的一種傳染性疾病，其傳播途徑主要是通過血液進行傳播，急性感染者有70%-85%可發展為慢性丙型肝炎，如果得不到有效治療，長期發展可能轉變為肝硬化、肝癌。因為丙型肝炎及其引發并發癥每年造成的死亡人數為35萬-50萬。HCV在分類中屬于單股正鏈RNA病毒，由5非編碼區（5NCR）、結構區（C、E區）、非結構區（NS區）和3非編碼區共4個區域組成，其中5非編碼區和結構區C區的序列非常保守。5NCR中的內源性核糖體進入位點（internal ribosome entry site.IRES）是HCV基因組中的翻譯起始位點，是HCV復制所必需的元件之一，其在病毒基因表達調控中發揮著重要的作用。Christopher J.Nulf等針對IRES設計反義鈦核酸（peptide nucleic acid，PNA）和反義LNA與IRES序列關鍵位點結合以達到阻斷翻譯的目的，研究結果發現，PNA和LNA都能有效地侵入HCV IRES的重要序列并阻斷翻譯。而Carl Laxton等在研究中不僅證明了反義LNA的有效抗病毒活性，半衰期長（>5天），到達肝最大濃度>100倍體外抗病毒活性所需的濃度，而且也驗證了其低的細胞毒性。近年來，在脫氧核酶的兩條結合臂上增加LNA而形成的鎖核酸核酶（LNAzyme）切割破壞IRES和C基因抑制病毒基因的表達也取得了一定的進展。針對HBV 5非編碼區合成LNAzyme、硫代DNAzyme、DNAzyme三種核酶，實驗結果發現，三種核酶中，LNAzyme對HCV RNA復制和熒光素酶基因表達具有更強的抑制作用，且隨用藥時間延長，抑制率呈增高趨勢，用四甲基偶氮唑藍（MTT）法監測細胞活性未發現有明顯改變。另一研究中觀察雙基因靶位和單基因靶位抑制作用時，結果HCV RNA和熒光素酶的抑制率在各組中分別為：單靶區NCR組62.12%，66.49%；單靶區C組61.39%，65.06%；雙靶區NCR/C組75.37%，73.30%，結果表明了雙基因靶位的抑制率優于單基因靶位。微小RNA（microRNA，miRNA）由21-25個核苷酸組成，屬于非編碼RNA。肝臟中含有大量的miRNA.而miR-122是含量最多的一種.約占肝臟所有miRNA總量的72%。miR-122對肝臟的正常功能和分化調節具有關鍵作用，但在丙型肝炎患者中大量表達，能促進HCV的復制和蛋白的表達。Miravirsen（SPC3649）是一種由LNA修飾的硫代反義寡核苷酸治療藥物，它的作用原理是與miR-122發生特異性結合，并且形成高度穩定的雜交雙鏈，阻斷miR-122對HCV的調節，最終抑制HCV的復制。最近報道，SPC3649通過結合pri-和pre-miRNAs的莖-環結構而抑制miR-122的生物活性。最初實驗用antagomir-122，miR-122ASO，LNA修飾的寡核苷酸在鼠體內進行，結果三組都有效地減少肝臟miR-122水平和血清膽固醇水平，并未觀察到毒性效應。在這些ASO中，LNA高親和力修飾寡核苷酸（SPC3649）對miR-122抑制能力最強。因此SPC3649隨后進一步在靈長動物上研究其安全性和效果。SPC3649的安全性測試在獼猴身上研究，顯示可以降低血清總膽固醇并有劑量依賴性，無嚴重毒性作用，證明了miR-122抑制藥物沒有影響肝的形態和功能。HCV慢性感染的黑猩猩用SPC3649治療顯示長期抑制HCV復制而沒有副作用。隨著臨床前研究的成功完成，SPC3649進入人類臨床試驗。第1階段的研究數據表明SPC3649有好的耐受性和劑量限制毒性，減少血清膽固醇水平。第2a階段臨床研究，評估多劑量SPC3649治療miR-112安全性、耐受性、藥物代謝動力學、療效，研究發現，SPC3649具有廣泛的抗病毒活性，有劑量依賴性和持續減少血清膽固醇和HCVRNA水平，并且未觀察到HCV基因組中存在mir-122結合位點的病毒抵抗，也未發現劑量限制性的不良反應事件。SPC3649比其他抗HCV藥物有幾個優點，不像大多數抗病毒藥直接作用于HCV，而是作用于miR-112能避免由于HCV基因組突變引起的藥物抵抗。

3.3HIV基因治療 自從高效抗反轉錄病毒治療（highly active antiretroviral therapy，HAART）被用于臨床治療艾滋病以來.雖一定程度上抑制患者HIV-1并改善病程發展，但是長期HAART會導致病毒耐藥和突變等問題，從而使治療艾滋病的效果逐漸下降。目前應用于HIV-1基因治療的策略主要包括反義RNA、RNA適體、核酶、RNA干擾、RNA誘餌和一些基于蛋白的抑制劑。LNA被應用這些治療方法中是為了增加靶向性和穩定性而增強抑制HIV-1作用。有研究比較反義DNA、反義LNA、LNA核酶、DNA核酶在細胞培養中阻斷HIV-1 RNA模板反轉錄和二聚作用的生物活性并抑制HIV-1生成，結果證明抑制HIV-1表達能力：反義LNA>LNA核酶>DNA核酶>反義DNA。Elmen J等在HIV-1保守區二聚作用起始位點（dimerization initiation site，DIS）應用反義LNA提高了抑制HIV-1的性能。另有研究鳥嘌呤-四聯體序列5-TGGGAG和17-mer序列T30177利用LNA修飾后抗HIV-1活性提高8倍。HIV-1反式激活應答元件（TAR）RNA59殘基莖，環結構干擾HIV反式激活蛋白Tat和其他細胞因子刺激病毒長末端重復（long terminal repeat，LTR）的轉錄延長，從而達到阻斷全長的艾滋病毒轉錄和復制的目的。研究中發現長度相同（12個殘基）的2-0-甲基寡核糖核苷酸（2-O-methyl oligoribonucleotide，OMe）、OMe/LNA、PNA都同強度與TAR結合并抑制HIV-1轉錄。此外，當通過陽離子脂質體轉染Hela細胞.發現3-羧基熒光素標記的12-mer OMe/LNA嵌合寡核苷酸可抑制特定序列。另有報道發現OMe寡核苷酸與40%-50%LNA（包括a-L-LNA or 29-硫代-LNA）雜合效果最佳，且長度不能低于12殘基。LNA應用于HIV-1基因治療方法中還有RNA適體。適體（aptamer）是從體外寡核苷酸篩選的能緊密結合靶分子的一段DNA或RNA。適體與RNA發夾結構通過環一環相互作用相互影響.被稱為識別RNA發夾結構的另一種反義寡核苷酸。其在抗HIV-1的應用研究多用于與反轉錄病毒蛋白Tat的肽競爭結合于TAR，即使兩個配體的結合位點不重疊。一旦結合，適體TAR采用合適構象不再適合與Tat產生聯系，最終抑制HIV-1。相對比，反義LNA雖與適體都具有較強的結合力和堿基配對潛能，但不能競爭于Tat。更重要的是我們發現LNA/DNA適體結合于TAR的特異性比LNA/DNA反義寡核苷酸高。

4.問題與展望

鎖核酸給被修飾物帶來極好的親和力和非常高的生物穩定性，無論在基因診斷還是基因治療上都起重要作用。也正是如此，LNA修飾寡核苷酸在設計時比普通寡核苷酸更短，而且LNA結構的靈活性使設計時容易達到設計者的期望，展現出了強大的效力，在臨床上比其他長的寡核苷酸具有更低的毒性。隨著進一步理解LNA的生理學和分子雜交熱力學及臨床實驗的不斷發展，將會更完美設計LNA，并提高其在不同領域中應用。