柚皮苷對腦缺血再灌注損傷的保護作用

劉 微， 張 洋， 郭建超， 練鵬影， 吳敏華， 丁文婷

柚皮苷對腦缺血再灌注損傷的保護作用

劉 微， 張 洋， 郭建超， 練鵬影， 吳敏華， 丁文婷

目的 研究柚皮苷(Naringin,NRG)對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用及星形膠質細胞是否參與其中。方法 柚皮苷連續灌胃7 d后進行大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)，缺血2 h后拔出線栓進行再灌注。24 h后TUNEL染色觀察凋亡細胞數量，蘇木精-伊紅(hematoxyli-eosin,HE)染色觀察形態學改變，免疫熒光染色分別檢測星形膠質細胞標記物膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和縫隙連接蛋白43 (connexin43,Cx43)。結果 同模型組相比，柚皮苷預干預后凋亡細胞數量顯著減少(P<0.05)，細胞損傷明顯減輕。免疫染色顯示柚皮苷可以減輕星形膠質細胞的激活程度，同時Cx43的表達也有所降低(P<0.05)。結論 柚皮苷預干預可有效減輕腦缺血再灌注損傷，該保護作用同降低星形膠質細胞Cx43表達密切相關。

柚皮苷； 缺血再灌注； 星形膠質細胞； Cx43

腦血管疾病是威脅人類健康的常見病、多發病，其中缺血性腦血管病發病率高達85%。近年來，大量研究發現星形膠質細胞密切參與腦缺血損傷，逐漸成為治療腦缺血損傷的重要靶點[1,2]。柚皮苷(Naringin,NRG)屬于黃酮類化合物，是從蕓香科植物柚中提取出的一種單體。它具有較強的清除自由基、抗氧化和抗炎等保護作用，因此能起到良好的保護血管、預防冠心病的作用[3,4]。最近柚皮苷對腦缺血的保護作用受到日益關注，研究表明柚皮苷可顯著降低大鼠腦缺血再灌注損傷側腦組織含水量,顯著縮小腦梗死體積,降低腦組織MDA含量，提高SOD活性[5]。然而星形膠質細胞是否參與柚皮苷對腦缺血的保護作用尚未見報道。本實驗采用線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，通過形態學和凋亡細胞數的觀察進一步證實柚皮苷的保護作用，從而形成有效地補充。另外，通過觀察柚皮苷對缺血再灌注損傷后星形膠質細胞的激活程度以及Cx43的表達，初步探討星形膠質細胞在柚皮苷保護中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年SD 大鼠，雄性，質量250～280 g，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。大鼠術前12 h 禁食不禁水。

1.2 藥物與試劑 柚皮苷(Sigma公司)；TUENL檢測試劑盒(Roche公司)；GFAP和Cx43分別購自Millipore和Abcam公司。

1.3 主要儀器 冰凍切片機(Leica公司)；OLYMPUS熒光顯微鏡；Image J 2x圖像分析軟件。

1.4 動物模型的制備和分組 采用改良的Zea-Longa 線栓法制作局灶性腦缺血大鼠模型。將大鼠腹腔內注射10%水合氯醛( 400 mg/kg) 麻醉后，仰臥固定，頸部正中切口，分離并暴露右側頸總及頸內、外動脈，并在頸內、外動脈分叉處結扎頸外動脈。以直徑0.26 mm 市售尼龍漁線為線栓，插入頸外動脈殘端19～22 mm，阻斷大腦中動脈起始端，扎緊結扎線并固定線栓，缺血2 h后拔出線栓。柚皮苷溶于生理鹽水，于手術前7 d開始灌胃(80 mg/kg/d)，對照組給予同等量的生理鹽水。剔除實驗期間死亡及模型制作不成功的大鼠，并及時予以補充。

1.5 HE染色 缺血再灌注24 h后各組大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，插管至升主動脈，用冰冷的生理鹽水和4%多聚甲醛進行灌注。取出大腦，依次置于15%和30%蔗糖溶液，然后進行冠狀冰凍切片，片厚10 μm，放至-80 ℃備用。行蘇木精-伊紅( HE) 染色以觀察缺血側海馬CA1區神經元病理改變。

1.6 TUNEL染色 采用TUNEL檢測試劑盒，按照說明書指南進行操作。Olympus顯微鏡下觀察并照相，計算缺血側海馬CA1區TUNEL陽性細胞數。

1.7 免疫組織熒光染色 腦組織冰凍切片用3% 正常羊血清封閉1 h，隨后加入GFAP 抗體( 1∶800)、Cx43(1∶400)，4 ℃孵育過夜，TBST 洗3次后加入熒光二抗，室溫避光孵育2 h。漂洗完后Olympus熒光顯微鏡下觀察并照相。采用Image J 圖像分析軟件測定Cx43陽性面積，計算陽性百分比。

2 結 果

2.1 柚皮苷對海馬CA1區凋亡細胞數量的影響 采用TUNEL試劑盒檢測凋亡細胞數量。如圖所示，同假手術組相比，缺血再灌注使海馬CA1區凋亡細胞數量明顯增多(P<0.05)，然而柚皮苷預干預使得凋亡細胞數量有所減少(P<0.05)，差異有統計學意義(見圖1、表1)。

2.2 柚皮苷對海馬CA1區病理學改變的影響 同假手術組相比，模型組神經元受損嚴重：神經細胞數量減少、排列不規則，胞漿呈嗜酸性變，胞核固縮、破裂、溶解等。與之相比，柚皮苷組神經元損傷有所減輕(見圖2)。

2.3 柚皮苷對海馬CA1區GFAP染色的影響 同假手術組相比，模型組星形膠質細胞明顯被激活：細胞體積變大，突起變粗，GFAP熒光染色強度明顯增加；而柚皮苷組星形膠質細胞的激活較模型組減輕(見圖3)。

2.4 柚皮苷對海馬CA1區Cx43表達的影響 同假手術組相比，缺血再灌注使海馬CA1區Cx43表達增加(P<0.05)，經柚皮苷干預后Cx43表達明顯偏低(P<0.05)，提示柚皮苷預干預對缺血再灌注損傷導致的Cx43升高有一定的抑制作用(見圖4、表1)。

表1 大鼠海馬CA1區凋亡細胞數和Cx43陽性 百分比統計

與假手術相比*P<0.05；與模型組相比#P<0.05

3 討 論

腦缺血具有高發病率、高死亡率、高致殘率和高復發率的特點，對國民健康造成極大的威脅，已成為嚴重的社會-醫學-經濟問題，因此，有關腦缺血預防和治療的基礎研究具有重大的公共健康意義。最近的研究表明柚皮苷可作為缺血性卒中高風險患者潛在的神經保護劑。有文獻報道柚皮苷可明顯改善腦缺血再灌注導致的神經損傷、減小腦梗死體積和水腫[6]，在本實驗中通過TUNEL和HE染色我們觀察到柚皮苷預干預可減少凋亡細胞數量，減輕神經細胞受損狀態，從形態學上補充了柚皮苷對腦缺血的預保護作用。以前的文獻表明，柚皮苷發揮保護作用的機制可能同下調NOD2、RIP2、NF-κB和MMP-9的表達，降低髓過氧化物酶、一氧化氮，抑制炎癥以及上調抗氧化狀態有關[6,7]。為了進一步明確柚皮苷對腦缺血的保護作用是否有涉及星形膠質細胞，我們首先通過免疫熒光染色觀察柚皮苷預干預后星形膠質細胞標記物GFAP的表達。GFAP是星形膠質細胞標記物，它可反映星形膠質細胞的激活程度。本實驗研究顯示柚皮苷可減輕缺血再灌注損傷對星形膠質細胞的激活，提示星形膠質細胞參與柚皮苷的預保護作用。縫隙連接蛋白43(connexin43,Cx43)主要表達于星形膠質細胞，是治療缺血性卒中藥物的重要靶點[8,9]。縫隙連接(gap junction,GJ)可介導電子耦合,允許<1.2 kD和直徑<1.5 nm的小分子快速傳播，為細胞間物質和信息的傳遞提供了直接通路。腦缺血早期，缺血中心區的自由基、無氧代謝產物、興奮性氨基酸以及凋亡啟動信號等通過星形膠質細胞GJ向中心區周圍、血供相對減少的半暗帶(ischemic penumbra，IP)和遠離缺血中心的腦組織傳播[10]。同時，由于缺血中心區細胞能量很快耗竭，缺血周圍如半暗帶區細胞內的ATP、葡萄糖、谷胱甘肽以及神經營養因子等營養物質通過GJ 順著濃度差流向梗死中心區垂死的細胞內[11,12]。缺血損傷比較嚴重(如缺血2 h，目前臨床上腦缺血從發生到治療的時間往往較長，90%都在2 h以上)時，傷害性因子的擴散作用大于有益因子的擴散作用，腦缺血急性期縫隙連接往往會有擴大損傷的作用[13,14]。我們的實驗表明柚皮苷可降低腦缺血再灌注后Cx43的表達，提示柚皮苷可通過下調Cx43減少自由基、無氧代謝產物、興奮性氨基酸以及凋亡啟動信號的擴散從而發揮保護作用。

綜上所述，星形膠質細胞在柚皮苷減輕腦缺血損傷過程中發揮重要作用，該研究為探討柚皮苷抗腦缺血損傷作用機制和臨床治療提供實驗依據。

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A:假手術組 B:模型組 C:柚皮苷組

圖1 柚皮苷可降低大鼠腦缺血再灌注24 h后的凋亡細胞數量(×400)

A：假手術組 B：模型組 C：柚皮苷組

圖2 柚皮苷可減輕大鼠腦缺血再灌注24 h后的細胞損傷(×400)

A：假手術組 B：模型組 C：柚皮苷組

圖3 柚皮苷減輕大鼠腦缺血再灌注24 h星形膠質細胞的激活(×400)

A：假手術組 B：模型組 C：柚皮苷組

圖4 柚皮苷減輕大鼠腦缺血再灌注24 h 后海馬CA1區Cx43的表達(×400)

The protective effect of naringin on cerebral ischemia reperfusion injury

LIUWei,ZHANGYang,GUOJianchao,etal.

(CollegeofFundamentalMedicalScience,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China)

Objective To study the protective effects of naringin on rats with focal cerebral ischemia and reperfusion and whether astrocyte participates in this effect.Methods Naringin group was pretreated intragastricly for consecutive 7 days before ischemia.Middle cerebral artery was occluded for 2 h and then reperfused for 24 h.The number of apoptotic cells was detected by TUNEL staining,and pathological changes were observed by hematoxyli-eosin (HE) staining.Immunofluorescent staining was used to observe astrocytic marker (glial fibrillary detection acidic protein,GFAP) and connexin43 (Cx43).Results Compared with ischemia group,pretreatment with naringin reduced the number of apoptotic cells (P<0.05),and significantly attenuated cell injury.Immunofluorescent staining showed that naringin attenuated astrocytic activation,and decreased the expression of Cx43 (P<0.05).Conclusion Naringin pretreatment can effectively attenuated cerebral ischemia reperfusion injury,and the protective effects are closely related with Cx43 in astrocytes.

Naringin; Ischemia reperfusion; Astrocytes; Cx43

1003-2754(2017)04-0292-03

2016-12-09；

2017-03-30

國家自然科學基金資助項目(No.81202817,81673772)；廣東省高等學校優秀青年教師培養項目(No.Yq2013041)；高等學校博士學科點專項科研基金(No.20124425120011)

(廣州中醫藥大學基礎醫學院，廣東 廣州 510006)

劉 微，E-mail:weiliu1980@yahoo.com

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