鈣調神經磷酸酶對阿爾茨海默病大鼠學習記憶及海馬區基質金屬蛋白酶-9的影響

劉倩倩， 陽 洪， 石勝良， 韋檸琳 ， 陳仕檢， 林保全

鈣調神經磷酸酶對阿爾茨海默病大鼠學習記憶及海馬區基質金屬蛋白酶-9的影響

劉倩倩1， 陽 洪1， 石勝良2， 韋檸琳1， 陳仕檢1， 林保全1

目的 探討鈣調神經磷酸酶對阿爾茨海默病大鼠學習記憶及海馬區基質金屬蛋白酶-9 (MMP-9)的影響。方法 采用 Aβ1-42海馬注射建立AD模型，以他克莫司(FK506)干預。用Morris水迷宮檢測大鼠的空間學習記憶能力，RT-PCR、免疫組化以及明膠酶譜技術檢測海馬區MMP-9的表達。結果 與對照組相比，AD模型組大鼠學習記憶能力明顯減退(P<0.01)，MMP-9基因轉錄、蛋白表達和酶活性均明顯增加(P<0.05)。FK506干預后，AD大鼠學習記憶能力明顯改善，其海馬區MMP-9基因轉錄減少、酶活性降低(P<0.05)。結論 抑制CaN激活可改善AD癥狀，可能與影響MMP-9的表達有關。

阿爾茨海默病； 鈣調神經磷酸酶； 基質金屬蛋白酶-9

阿爾茨海默病 (Alzheimer’s disease,AD)是以認知功能減退及行為學改變為主要特點的神經系統退行性疾病，其主要的病理學特點是神經原纖維纏結、細胞外淀粉樣老年斑的形成、突觸損傷、神經元細胞調亡等。鈣調神經磷酸酶(Calcineurin,CaN)是一種活性受Ca2+/CaM調節的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，它能上調細胞因子及炎癥因子活性，在大腦皮質、海馬神經元中表達最為豐富，而在星形膠質細胞中表達甚微。CaN也可參與神經遞質和激素的釋放以及突觸可塑性調節，其抑制劑已廣泛應用于腫瘤、心血管、器官移植后抗排斥反應等治療。Hong[1]等研究發現CaN抑制劑FK506可穿透血腦屏障，影響基質金屬蛋白酶-9(Matrix Metalloproteinase-9,MMP-9)表達，并減少AD大鼠中β淀粉樣蛋白(Amyloid protein，Aβ)的沉積。FK506也可抑制氧化應激、維護血腦屏障結構和功能完整而發揮腦保護作用[2]，但其機制尚不明確。本實驗通過FK506腹腔注射干預，觀察大鼠行為學改變及海馬區MMP-9的表達來探討CaN作用于AD的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 健康SD雄性大鼠36只；體重220～250 g,3～4月齡(由廣西醫科大學動物實驗中心提供)；Aβ1-42(美國sigma，用前先溶于PBS，前3 d 37℃孵育，使其變為聚集狀態)；FK506(美國Selleckchem)；RNAiso Plus、逆轉錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMII (Takara)；兔抗大鼠基質金屬蛋白酶-9抗體；SP免疫組化試劑盒、DAB試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組 36只大鼠隨機分為AD模型組、FK506處理組及對照組(每組12只)。麻醉大鼠后平顱位固定于腦立體定向儀上。參照包新民所著的大鼠腦立體定位圖譜，確定兩側海馬坐標:前囟后3 mm,正中矢狀縫左右旁開2 mm,硬腦膜下3.5 mm。按上述位點鉆孔后，每側海馬注射5μl Aβ1-42，10 min內注完，并留針5min以保證藥物充分彌散。設0.01 mol PBS注射作為對照組。之后進行藥物干預。對照組和模型組按0.2 mg/100 g腹腔注射生理鹽水；FK506組按0.2 mg/100 g注射FK506，隔日一次，共30 d。

1.2.2 大鼠行為學觀察 應用Morris水迷宮系統對大鼠進行定向航行和空間搜索實驗。前5 d，每只大鼠分別從4個不同象限入水，記錄大鼠尋找并爬上平臺(目標象限距水面下2 cm處)所需時間(逃避潛伏期)，取4次平均值作為每天的逃避潛伏期。若120 s內未找到平臺,則由助手幫助其上平臺。第6天撤去平臺,將大鼠放入平臺所在對角線的象限內,記錄2 min內大鼠穿過隱匿平臺次數以及在目標象限游泳時間來評價小鼠記憶成績指標。

1.2.3 RT-PCR 各組隨機選取6只，迅速分離左側海馬，參照RNAiso Plus試劑說明書提取總RNA，逆轉錄成cDNA后(37 ℃孵育15 min；85 ℃孵育5 s，4 ℃終止反應)，進行擴增，MMP-9：上游引物5’-GATCAGCCGGGAACGTATCT-3’；下游引物5’-TTCACCCGGTTGTGGAAACT-3’，產物：198 bp。GAPDH:上游引物5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’；下游引物5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’,產物：135 bp。反應條件為：95 ℃預變性30 s，然后進入循環反應，95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40個循環。表達量的多少通過內參GAPDH比較來反映。

1.2.4 免疫組化染色 各組剩余6只，經心臟灌注生理鹽水沖洗和多聚甲醛固定后取腦，常規石蠟包埋切片，取海馬冠狀層面行免疫組化染色，DAB顯色。MMP-9抗體的濃度為1∶75。陰性對照用PBS代替一抗。每個標本取2張切片，每張切片隨機選取5個不重疊的海馬視野區高倍鏡下觀察，應用IPP6.0軟件測定其積分光密度值(IOD)和陽性面積(area)，計算平均積分光密度(IOD/area)。

1.2.5 明膠酶譜法 取各組剩余6只右側海馬，參照MMP Zymograph assay Kit試劑說明書檢測MMP-9活性。凝膠經雙色紅外成像系統拍攝記錄，采用Quantity one 軟件計算條帶灰度值，并以此來反映酶活性高低。

2 結 果

2.1 定向航行及空間搜索實驗 前5 d各組大鼠搜索平臺的平均潛伏期均逐日縮短；AD組大鼠逃避潛伏期較對照組及FK506組明顯延長，而穿越隱匿平臺的次數及在目標象限游泳時間明顯減少 (P<0.05) (見表1)。

2.2 RT-PCR結果 AD模型組MMP-9的mRNA表達量為(1.39±0.19)，與FK506處理組(1.00±0.42) 相比，差異有統計學意義(P<0.05)；對照組為(0.93±0.16)，與AD組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 免疫組化結果 免疫組化的陽性細胞顯色為胞漿或胞膜染為棕黃色或棕褐色。AD組MMP-9蛋白的IOD/area為(0.21±0.02)，FK506組為(0.18±0.02)，兩組比較無顯著性差異。對照組為 (0.14±0.01)，與AD組比較，差異有統計學意義(P<0.05)(見圖1)。

2.4 明膠酶譜結果 AD模型組MMP-9酶活性為(2.28±0.88)，對照組為(0.57±0.09)，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)；FK506組為(1.58±0.31)，與AD組比較，差異有統計學意義(P<0.05)(見圖2)。

表1 各組大鼠水迷宮實驗結果比較±s)

AD組與對照組比較*P<0.01；FK506組與AD組比較#P<0.05,△P<0.01；FK506組與對照組比較P<0.05

圖1 各組大鼠海馬區MMP-9表達的改變(×400)

圖2 各組大鼠海馬區MMP-9酶活性的改變

3 討 論

AD是由多因素引起，涉及多種病理機制，并有多種病理表現的“多因異質性疾病”。腦內Aβ代謝異常并過度沉積后，通過一系列瀑布樣放大效應，對腦細胞造成毒性作用，引起神經元及突觸功能失調，另外沉積的Aβ作用于神經膠質細胞產生炎癥反應、氧化應激等，從而加強或促進AD的病理過程。本研究采用雙側海馬區注射Aβ1-42誘導AD大鼠模型，與側腦室注射相比，避免了聚集態的Aβ1-42在海馬區擴散不均、模型成功率低等缺點。而通過水迷宮實驗我們發現AD組大鼠較正常對照組穿越平臺潛伏期明顯延長，穿越平臺次數及在目標象限游泳時間明顯減少，說明本實驗AD大鼠造模成功。

MMPs屬于含有Zn2+和Ca2+的蛋白水解酶家族，能降解幾乎所有的細胞外基質。也是目前在腦脊液中發現的與Aβ代謝密切相關的重要金屬酶[3]。MMP-9作為一種明膠酶，在AD患者海馬區，特別是淀粉樣斑塊聚集的星形膠質細胞周圍表達豐富。MMP-9能降解Aβ[4]，但同時降解細胞外基質、髓鞘堿性蛋白、層粘連蛋白等，并能破壞血腦屏障的完整性，從而加重AD患者的大腦損傷。其在中樞神經系統中還參與調節突觸可塑性[5]、細胞調亡[6]等過程。而本研究通過RT-PCR、免疫組化及免疫印跡技術發現AD組大鼠海馬區MMP-9在基因或蛋白表達水平均較對照組明顯增高，說明MMP-9在AD發病過程中發揮重要作用。研究發現[7]，敲除MMP-9基因后，可防止因氧化應激導致的血腦屏障破壞，而氧化應激損傷可加重AD的病理過程。Lorenzl等[8]通過明膠酶譜技術也發現AD患者血漿中MMP-9表達明顯增高。從而，我們可以推測MMP-9可能作為早期診斷AD的重要分子生物學指標。

研究認為，Aβ的異常產生和蓄積影響細胞膜上的AMPA、NMDA等鈣離子通道以及谷氨酸受體，導致細胞內鈣離子增多和IP3生成，它們可作用于內質網膜上的RyR和IP3R3而導致鈣離子大量流入細胞質，從而激活CaN[9]，CaN活化后去磷酸化激活活化T細胞核因子 (nuclear factor of activated T cells,NFAT)，然后NFAT進入細胞核開始轉錄，介導一系列的生理病理反應，包括tau蛋白的去磷酸化[10]、炎癥反應、細胞調亡等。而MMP-9基因可結合NFTA多個位點[11]。本研究中，急性給予FK506干預后，與AD組大鼠相比，其穿越平臺潛伏期明顯縮短，而穿越隱匿平臺次數及在目標象限游泳時間增多，說明抑制CaN活性可改善AD大鼠的學習記憶能力。同時，我們也發現FK506組中MMP-9基因產物及酶活性較AD組降低，說明CaN可能通過上調MMP-9的表達從而緩解AD癥狀。但是FK506組較對照組大鼠MMP-9表達有增加，可能與MMP-9參與降解Aβ，或者FK506尚不能完全逆轉神經功能損傷，這與Hong[1]等人的研究結果一致，因此，我們仍需大樣本的實驗來進一步驗證。

本實驗運用動物實驗說明，抑制CaN激活可能通過下調MMP-9的表達而改善AD癥狀，但其作用于AD的具體機制仍需進一步探討。對各組大鼠Aβ、CaN活性的測定以及其他MMPs家族成員的檢測可能更有助于我們了解其作用于AD 的機制，從而找到新的神經保護性藥物。

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Effect of Calcineurin on learning and memory and MMP-9 of hippocampus region in rats with Alzheimer’s disease

LIUQianqian,YANGHong,SHIShengliang,etal.

(DepartmentofNeurology,FourthAffiliatedHospitalGuangxiMedicalUniversity,Guangxi545005,China)

Objective To explore the effect of calcineurin on learning and memory and MMP-9 of hippocampus region in Aβ1-42-induced AD rats.Methods AD rats were established by direct Aβ1-42injection.The learning and memory ability and the expression of MMP-9 were analyzed.Results FK506 could improve learning and memory ability,reduce the expression of MMP-9 in AD rats.Conclusions Inhibiting calcineurin may influence the expression of MMP-9,thus alleviate the AD symptom.

Alzheimer’s diseas; Calcineurin; MMP-9

1003-2754(2017)04-0339-03

2016-12-23；

2017-03-29

地區科學基金項目(No.81460183)

(1.廣西醫科大學第四附屬醫院神經內科，廣西 柳州 545005;2.廣西醫科大學第二附屬醫院神經內科，廣西 南寧 540021)

石勝良，E-mail:ssl_1964@163.com

R749.1

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