染色體9p21.3多態性與頸動脈斑塊和神經功能缺損的相關性探討

孫家蘭， 楊 康， 黃 澍， 胡榮郭， 傅 毅， 李龍宣

染色體9p21.3多態性與頸動脈斑塊和神經功能缺損的相關性探討

孫家蘭1， 楊 康2， 黃 澍1， 胡榮郭1， 傅 毅2， 李龍宣1

目的 探討中國漢族人群急性腦梗死患者染色體9p21.3基因多態性與頸動脈斑塊、神經功能缺損的相關性。方法 采用回顧性病例對照研究，556例急性缺血性卒中病例(無斑塊為對照組231例、單斑塊組67例、多斑塊組258例)，根據美國國立衛生院卒中量表(NIHSS)進行評分，頸動脈超聲檢測頸動脈斑塊。用SPSS 19.0軟件統計數據。結果 斑塊組的平均住院天數明顯多于無斑塊組(P<0.05)。頸動脈斑塊與入院時的NIHSS評分之間呈正相關(P<0.05)。無論是在小于等于65歲還是超過65歲兩個年齡段，9p21區帶上所有6個SNPs(rs10757278、rs1333049、rs2383206、rs1537378、rs4977574和rs2383207)的等位基因頻率分布在無斑塊組(對照組)與斑塊組均無顯著性意義(P>0.05)。同時發現頸動脈斑塊的存在導致嚴重神經功能缺損(P<0.001；OR=2.29；95%CI=1.54～3.40)。單斑組、多斑組患者對神經功能缺損的影響分別為無斑塊組的1.87倍(95%CI，1.02～3.42；P=0.043)和2.42倍(95%CI，1.59-3.66；P<0.001)，而頸動脈斑塊的面積大小與神經功能缺損無明顯相關性。結論 6個9p21.3區域SNP位點與頸動脈粥樣硬化之間無關聯性；急性腦梗死發病期有頸動脈斑塊的患者有更嚴重的神經功能缺損。

急性腦梗死； 9p21.3多態性； 頸動脈斑塊； 神經功能缺損

腦梗死(cerebral infarction，CI)是指各種原因引起的腦部血液供應障礙，包括動脈粥樣硬化性腦血栓形成、腦栓塞、腔隙性腦梗死等。越來越多的研究顯示腦梗死的發生可能與特定的基因多態性有關[1]。有研究發現9p21.3號染色體上單核苷酸多態性(SNPs)也是腦梗死的危險因素[2]，是頸動脈斑塊形態的相關因素[3]，包括出現有無斑塊、斑塊面積和體積。動脈粥樣硬化斑塊的形成會增加卒中風險[4]。因此，我們采用病例對照研究方法研究了上海市四家醫院9p21.3基因相關的單核苷酸多態性與頸動脈斑塊的相關性，且探討動脈粥樣硬化斑塊與入院時神經功能缺損之間的相關性。

1 資料與方法

1.1 資料 我們回顧性地共納入從2012年10月-2015年12月來自上海四家醫院(上海市浦東新區公利醫院、上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院、復旦大學附屬閔行醫院、上海中醫藥大學附屬岳陽醫院)556例首次急性腦梗死患者(見表1)，根據中國急性腦梗死指南2010[4]。所有卒中患者經頭部計算機斷層掃描(CT)/磁共振成像(MRI)。急性期腦梗死的定義如下：(1)急性局灶性或整體性神經功能缺損的發生持續24 h或更長時間，CT或MRI有腦缺血損害的證據；(2)CT或MRI掃描無顱內出血。除外原發性腦腫瘤、腦轉移、硬膜下血腫、癲癇發作后癱瘓、腦外傷或全身性疾病(感染、肝臟或腎臟疾病)。高血壓被定義為使用降壓藥物或基線血壓≥140/90 mmHg。糖尿病被定義為空腹血糖≥7.0 mmol/L或使用降糖藥物。頸動脈斑塊定義為頸動脈內膜中層厚度(IMT)≥1.5 mm，進行頸動脈彩色多普勒超聲檢查在普通/頸內動脈和椎動脈的最大斑塊面積(mm2)是由所有頸動脈斑塊的最大軸線長度相乘估計[5]。我們還進行了分層分析，將556例腦梗死患者根據超聲檢測到的頸動脈斑塊的數量分成：無斑塊組、單斑塊組或多個斑塊組。在556例患者中，無斑塊組231例(41.5%)，單斑塊組67例(12.1%)，多斑塊組258例(46.4%)。無斑塊組男性占62.8%、單斑塊組男性占65.7%、多斑塊組男性占65.1%。同時根據國立衛生研究院卒中量表(NIHSS)評分，結果分為輕度(NIHSS≤3)和中重度(NIHSS≥4)[6,7]。所有患者均按照急性腦梗死治療指南接受治療。根據世界衛生組織的年齡分級標準，我們將所有腦梗死患者分為兩組：年輕組(≤65歲)和老年組(>65歲)。經Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗結果顯示，本研究群體在各基因位點上的分布頻率均符合遺傳平衡，具有群體代表性，且經LDR均檢測出野生型、純合和雜合變異型3種基因型。

1.2 方法 所有被檢者禁食12 h，晨起空腹抽取靜脈血5 ml，在EDTA抗凝管中混勻，其中，2 ml用作DNA提取；另3 ml靜脈血分離作血清血糖、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)測定，并記錄血壓和相關臨床資料。采用酚氯仿法提取全血基因組DNA，通過引物設計軟件Primer Express、Oligo進行引物構建(見表1)，再經PCR-LDR檢測并進行基因SNPs分型。多重PCR擴增：PCR反應總體積為20 μl。擴增步驟：95 ℃預變性120 s，然后按94 ℃ 30 s、50 ℃ 90 s、65 ℃ 60 s共35循環，最后65 ℃延長至10 min；循環結束后，取2 μl反應產物在3.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測反應。多重LDR反應：LDR反應總體積為10 μl。反應循環參數：95 ℃預變性120 s，然后按94 ℃ 15 s、50 ℃ 25 s共40循環。后各取1 μl LDR連接產物與1 μl ABI GS-500 ROX熒光標記分子量標準和1 μl去離子甲酰胺上樣液混合，95 ℃加熱變性2 min，置于冰水混合物上急速冷卻。LDR產物測序電泳并分析：使用PRISM 3730型DNA測序儀，于5%聚丙烯酰胺和5 mol/L尿素中進行3000V毛細管電泳2.5 h；采用GENESCANTM672軟件、Genemapper軟件進行數據收集并進行SNPs位點的基因分型。PCR產物核苷酸序列測定：隨機選取上述染色體9p21.3片段6個位點的野生型、純合和雜合變異型PCR產物各2例，由上海翼和應用生物技術有限公司直接測序驗證。

1.3 統計學方法 統計數據用SPSS統計軟件(Vrsion 18.0)進行統計，先行單因素分析篩查可能的危險因素變量再引入多因素分析。計量資料的比較采用正態分布性檢驗及方差齊性檢驗，對于正態分布資料，使用t檢驗；對于偏態分布資料，使用Mann-WhitneyU法檢驗。計數資料采用χ2檢驗，計算等位基因和基因型頻率。再通過多元Logistic回歸模型，分析校正年齡、性別、高血壓等暴露因素后的比值比(odds ratio，OR)及95%置信區間(confidence interval,CI)，對有統計學差異的位點建立遺傳模型分析易感性并探討基因交互作用。統計效能，α雙側=0.05。

2 結 果

2.1 有斑塊組患者空腹血糖和收縮壓數據值較高 有統計學差異(P<0.05)。但是3組之間的高血壓和血脂數據無顯著差異性(P>0.05)。入院時，斑塊組比無斑塊組有較高的NIHSS評分，有統計學差異(4.75±5.14 vs 3.10±4.37，P<0.05)，但單個和多個斑塊組之間的NIHSS評分(4.78±5.28 vs 4.74±5.12)無顯著差異。斑塊組的平均住院天數明顯多于無斑塊組(P<0.05)。頸動脈斑塊與入院時的NIHSS評分之間的呈正相關(P<0.05)(見表2)。

2.2 無論是在小于等于65歲還是超過65歲兩個年齡段，9p21區帶上所有6個SNPs(rs10757278、rs1333049、rs2383206、rs1537378、rs4977574和rs2383207)的等位基因頻率分布在無斑塊組(對照組)與斑塊組均無顯著性意義(P>0.05)(見表3)。

2.3 為了排除多種危險因素和卒中亞型的影響 我們采用Logistic回歸方法研究斑塊對入院時神經功能缺損的影響，發現頸動脈斑塊的存在導致嚴重神經功能缺損(P<0.001；OR=2.29；95%CI=1.54～3.40)。單斑組、多斑組患者對神經功能缺損的影響分別為無斑塊組的1.87倍(95%CI，1.02～3.42；P=0.043)和2.42倍(95%CI，1.59～3.66；P<0.001)(見表4)。

表1 6個位點的基因庫序列號、引物序列和PCR長度

表2 腦梗死患者中無斑塊組、單個斑塊組和多個斑塊組的一般資料

表3 急性腦梗死患者9p21基因多態性與頸動脈斑塊的關系

表4 急性腦梗塞患者神經功能缺損與頸動脈斑塊的關系

3 討 論

rs10757278、rs1333049、rs2383206、rs1537378、rs4977574和rs2383207這6個位點集中在9號染色體長臂21.3區域一段長約100 kb的DNA序列內，與兩個已知的抑癌基因-細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子2A和2B(cyclin-dependent kinase inhibitors 2A and 2B，CDKN2A and CDKN2B)處于同一連鎖不平衡結構域中。CDKN2A和CDKN2B分別編碼CDK4(INK4)家族中的p16INK4a和pl5INK4b及一個與家族抑制子完全無關的蛋白p14ARF，對調節細胞增殖、衰老及凋亡都起著重要作用，并能誘導轉化生長因子而影響動脈粥樣硬化的發生，可能與既往造成AS的傳統危險因素的發生機制有所不同[8]。

許多研究證實染色體9p21.3的基因多態性對腦梗死的作用[9]。同樣，也有幾項研究已經驗證了9p21.3基因突變與頸動脈斑塊的相關性。有文獻報道，老年患者(>65歲)中rs1333049的C等位基因增加頸動脈斑塊風險是G等位基因的1.24倍(95%CI，1.13～1.36；P<0.001)[10]。Lin等還發現rs2383207的G等位基因比C等位基因明顯增加頸動脈內膜-中膜厚度(P=0.007)，但只限男性而不是女性[11]。然而急性腦梗死患者9p21.3基因多態性和頸動脈斑塊之間的關系目前尚不清楚。本研究中，9p21.3區域6個SNP位點與頸動脈粥樣硬化之間無關聯性。我們還發現，急性腦梗死發病期有頸動脈斑塊的患者有更嚴重的神經功能缺損。

我們的研究表明頸動脈斑塊與急性腦梗死發病時的神經功能缺損有關。另一項研究顯示頸動脈狹窄的程度是預測腦梗死癥狀的唯一依據[12]。在我們的結果中，頸動脈斑塊與急性腦梗死的嚴重程度有關。然而，斑塊面積大小對急性腦梗死嚴重程度沒有預測價值。

總之，我們探討了9p21.3區域的基因多態性(rs10757278、rs1333049、rs2383206、rs1537378、rs4977574和rs2383207)這6個位點在急性腦梗死患者頸動脈粥樣硬化中的風險作用，急性腦梗死發作時頸動脈斑塊與神經功能缺損有關，頸動脈斑塊的面積大小與神經功能缺損無明顯相關性。但結論僅局限于小范圍四家醫院的人群和樣本的病例對照研究，以后應該進一步擴大樣本進行相關前瞻性研究。

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Carotid plaques are associated with variants on Chromosome 9p21.3and neurological dysfunction in acute ischemic stroke

SUNJialan,YANGKang,HUANGShu,etal.

(DeptmentofNeurology,GongliHospital,PudongNewArea,Shanghai200135,China)

Objective To investigate the relationship between chromosome 9p21.3 gene polymorphism and carotid plaques,the correlation with nerve function defect in Chinese han population with acute cerebral infarction.Methods A retrospective case-control study was conducted,including 556 cases of acute ischemic stroke (no plaque for the control group,231 cases,single plaque group,67 cases,plaque group,258 cases),Risk factors,the national institutes of health stroke scale (NIHSS) score at admission were obtained,and carotid ultrasonography was performed to detect carotid plaques.SPSS19.0 software was used for statistical data.Results The average hospitalization days of plaque group was obviously more than no plaque group (P< 0.05).Carotid plaques were positively correlated with NIHSS score on admission to hospital (P< 0.05).In groups both less than or equal to 65 years old and over 65 years old,9 p21zones on all six SNPs (rs10757278 rs1333049 rs2383206,rs1537378,rs4977574 and rs2383207) allele frequency distribution in the absence of plaque group (control group) and plaque group had no significant (P> 0.05).Also found that the presence of carotid plaques lead to severe neurologic deficits (P<0.001;OR=0.001;95%CI,1.54～3.40).Single spot,spot group’s influence on nerve function defect in patients respectively was 1.87 times (95% CI,1.02-3.42;P=1.02) and 2.42 times (95%CI,1.59～3.66;P< 0.001) risk factors than no plaque group.However,the area size of carotid plaques has no obvious correlation with neural function defect.Conclusions Six 9p21.3 regional SNP loci had no correlation with carotid plaques.The onset of acute cerebral infarction patients with carotid plaques have more severe neurologic deficits.

Acute cerebral infarction; 9p21.3 gene polymorphism; Carotid plaques; Neurological dysfunction

1003-2754(2017)04-0295-04

2016-12-20；

2017-03-30

上海市浦東新區科技發展基金創新基金(PKJ2013-Y01)；上海市衛生和計劃生育委員會科研資金(201540157)；上海市浦東新區衛生系統領先人才培養計劃(PWR12014-05)；上海市浦東新區衛生系統重點學科建設資助(PWZx2014-08)；上海市醫學重點專科建設計劃項目(ZK2015B16)；上海市自然科學基金項目(15ZR1437200)；國家自然科學基金面上項目(81571203)

(1.上海市浦東新區公利醫院神經科,上海 200135； 2.上海交通大學附屬瑞金醫院神經科，上海 200025)

李龍宣，E-mail:Longxuanlee2006@yahoo.com

R743.3

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