促紅細(xì)胞生成素對新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元體外缺氧缺糖損傷的保護(hù)作用研究

王 妮， 郝 寧， 杜和謙， 呂曉紅

促紅細(xì)胞生成素對新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元體外缺氧缺糖損傷的保護(hù)作用研究

王 妮， 郝 寧， 杜和謙， 呂曉紅

目的 研究rhEPO對新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元氧糖剝奪(OGD)損傷的保護(hù)作用及rhEPO的作用劑量及作用時間。方法 新生Wistar大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元原代培養(yǎng)7 d～11 d，隨機(jī)分為正常對照組、OGD損傷組和rhEPO處理組。(1)建立皮質(zhì)神經(jīng)元的OGD模型，給予不同劑量的rhEPO(0.1、1、10、100 U/ml)；(2)在不同時間(OGD損傷后0 h、24 h、48 h)給予10 U/ml rhEPO。觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，MTT法檢測細(xì)胞存活率。結(jié)果 與OGD損傷組比較，rhEPO(0.1、1、10 U/ml)處理可增加OGD損傷的皮質(zhì)神經(jīng)元的存活率(P<0.05)，且濃度為10 U/ml時rhEPO保護(hù)作用最強(qiáng)(P<0.05)。皮質(zhì)神經(jīng)元OGD損傷后立即加入rhEPO(10 U/ml)保護(hù)作用最強(qiáng)(P<0.05)，損傷后24 h及48 h給藥沒有增加皮質(zhì)神經(jīng)元存活率。結(jié)論 rhEPO對體外缺氧缺糖損傷的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用，rhEPO有效濃度為0.1～10 U/ml，且其濃度為10 U/ml時保護(hù)作用最強(qiáng)；rhEPO 在神經(jīng)元損傷后立即給藥保護(hù)作用最強(qiáng)。

促紅細(xì)胞生成素； 皮質(zhì)神經(jīng)元； 缺氧缺糖損傷； 保護(hù)作用

促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)主要由肝臟和腎臟合成，能夠促進(jìn)紅細(xì)胞生成。重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythropoietin，rhEPO)在腦缺血損傷中的保護(hù)作用和保護(hù)機(jī)制已經(jīng)被大量研究證實，但眾多研究未明確rhEPO在腦缺血性損傷中的有效劑量及作用時間窗。為避開動物實驗中藥代動力學(xué)的影響，本實驗建立體外新生大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)損傷模型，研究EPO對缺血性腦損傷的保護(hù)作用，為臨床應(yīng)用rhEPO治療急性腦梗死提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 動物 24 h內(nèi)新生健康清潔級Wistar大乳鼠，雌雄不限，由吉林大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK(吉)2013-0001。

1.1.2 主要試劑 rhEPO由沈陽三生制藥股份有限公司提供(10000 kU/L，生產(chǎn)批號：201506114V)；DMEM/F12培養(yǎng)基、Neurobasal-A培養(yǎng)基、B27、L-谷氨酰胺購自美國Gibco公司；青霉素/鏈霉素(160 萬U/100ml)、噻唑藍(lán)(MTT)、DMSO購自美國Sigma公司；胰酶購自美國Difco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；兔抗鼠神經(jīng)元特異烯醇化酶(NSE)、山羊抗兔免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購自武漢博士德公司。

1.1.3 實驗設(shè)備 由吉林大學(xué)第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院神經(jīng)內(nèi)科實驗室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代皮質(zhì)神經(jīng)元的培養(yǎng) 取2只新生Wistar大鼠于75%酒精中浸泡消毒，無菌分離大腦皮質(zhì)，剪碎腦組織，加入8 ml濃度為0.25%的胰酶37 ℃消化20 min；用含20%胎牛血清的DMEM/F12終止消化，吸量管吹打30～40次；用200目濾網(wǎng)過濾2次，離心后棄上清液；加入2～4 ml含10%胎牛血清的DMEM/F12，吹打制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)后以1×106/L、5×105/L的密度分別接種在96孔板和24孔板的細(xì)胞爬片上(96孔板及24孔板的細(xì)胞爬片預(yù)先以1%的多聚賴氨酸包被過夜)，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、95% N2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；種板4 h后全量換液，更換為神經(jīng)元專用培養(yǎng)基(內(nèi)含48.5 ml Neurobasal-A培養(yǎng)基、1 ml B27、0.5 ml L-谷氨酰胺、313 μl青鏈霉素)；種板48 h后加入5-溴-2’-脫氧尿苷(終濃度為5 μmol/L)；種板72 h后全量換神經(jīng)元專用培養(yǎng)液，以后每72 h半量換液，倒置顯微鏡下定期觀察細(xì)胞形態(tài)變化(見圖1)。

1.2.2 體外培養(yǎng)神經(jīng)元純度鑒定 培養(yǎng)7 d后取出細(xì)胞爬片，用NSE抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，陰性對照用PBS代替一抗。胞漿或突觸內(nèi)含棕黃色顆粒為神經(jīng)元，高倍鏡下每張細(xì)胞爬片隨機(jī)選取5個視野，陽性率=神經(jīng)元數(shù)/細(xì)胞總數(shù)。計數(shù)陽性神經(jīng)元達(dá)90%以上，符合實驗要求。

1.2.3 神經(jīng)細(xì)胞OGD模型制備 根據(jù)我們之前的實驗發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元培養(yǎng)至第7天～第11天為生長穩(wěn)定期，且OGD 15 h損傷對神經(jīng)元生存率的影響適中[1]，選取處于穩(wěn)定期的細(xì)胞制備OGD模型。取培養(yǎng)至第7天的神經(jīng)元，將培養(yǎng)液更換成無糖DMEM液，置于37 ℃含95%N2和5%CO2的缺氧箱中培養(yǎng)15 h。

1.2.4 實驗分組

1.2.4.1 不同劑量rhEPO處理與OGD損傷的關(guān)系 神經(jīng)元培養(yǎng)至第7天時取2塊96孔板，編號為1、2，分為3組：(1)正常對照組：選擇1號板的10孔為正常對照組；(2)OGD損傷組：2號板神經(jīng)元進(jìn)行OGD15h，選擇10孔(B2-B11)為OGD損傷組；(3)rhEPO處理組：取2號板，OGD15 h后選擇C2-C11、D2-D11、E2-E11、F2-F11孔分別給予10 μl/孔rhEPO，使rhEPO終濃度為100 U/ml、10 U/ml、1 U/ml、0.1 U/ml，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，于光鏡下觀察各組神經(jīng)元形態(tài)變化，噻唑藍(lán)[3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]法測量各組光密度(optical delnsity，OD)值，計算神經(jīng)元存活率。

1.2.4.2 不同時間rhEPO處理與OGD損傷的關(guān)系 根據(jù)1.2.4.1得最佳劑量為10 U/ml，種板第7天取2塊96孔板，編號為A、B，分3組：(1)正常對照組：取A板，選擇10孔為正常對照組；(2)OGD損傷組：B板神經(jīng)元進(jìn)行OGD15 h，選擇10孔(B2-B11)為OGD損傷組；(3)rhEPO處理組：取B板，分別于OGD 15 h后0 h、24 h、48 h選擇C2-C11、D2-D11、E2-E11給予終濃度為10 U/ml的rhEPO。最后于光鏡下觀察各組神經(jīng)元形態(tài)變化，MTT法測量各組OD值，計算神經(jīng)元存活率。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征 神經(jīng)元接種4 h后幾乎全部貼壁，并可觀察到少數(shù)細(xì)胞開始長出短小突起，胞體折光性較強(qiáng)，說明細(xì)胞活性良好；48 h后，胞體增大，細(xì)胞突起增多延長；72 h時，神經(jīng)元胞體繼續(xù)增大，突起繼續(xù)延長且形態(tài)多樣，胞體折光性強(qiáng)，少數(shù)區(qū)域出現(xiàn)胞體聚集現(xiàn)象；種板7 d時神經(jīng)元生長旺盛，細(xì)胞突起增多伸長，相互交織成密集的神經(jīng)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。

2.2 神經(jīng)元純度鑒定 陽性細(xì)胞表現(xiàn)為胞體及突觸呈棕黃色，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，陰性細(xì)胞表現(xiàn)為胞體及突觸無著色，僅細(xì)胞核被染為藍(lán)紫色(見圖2)。計數(shù)神經(jīng)元陽性率在90%以上。

2.3 不同劑量rhEPO對OGD損傷后原代皮質(zhì)神經(jīng)元存活率的影響 與OGD損傷組相比，rhEPO濃度為0.1～10 U/ml，可提高原代皮質(zhì)神經(jīng)元存活率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；當(dāng)rhEPO濃度為10 U/ml時，神經(jīng)保護(hù)作用最強(qiáng)，與其他劑量組比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變(見圖3)。OGD損傷組細(xì)胞部分壞死，胞體及胞核腫大并空化，細(xì)胞間突觸聯(lián)系減少；少數(shù)細(xì)胞凋亡，胞體縮小，胞膜尚完整；多數(shù)細(xì)胞仍存活。rhEPO終濃度0.1 U/ml及1 U/ml組除中央可見皺縮細(xì)胞，仍有較多神經(jīng)細(xì)胞存活。rhEPO終濃度10 U/ml組，存活細(xì)胞數(shù)量最多，細(xì)胞形態(tài)完整，皺縮細(xì)胞散布于正常神經(jīng)元之間。而rhEPO終濃度為100 U/ml組存活細(xì)胞數(shù)量最少，有大量細(xì)胞碎片分布(如圖3F箭頭所示)。

2.4 不同時間rhEPO對OGD損傷后原代皮質(zhì)神經(jīng)元存活率的影響 與OGD損傷組、OGD損傷后24 h、48 h rhEPO處理組相比，OGD損傷后立即給予終濃度為10 U/ml的rhEPO處理，可提高原代皮質(zhì)神經(jīng)元的存活率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與OGD損傷組相比，OGD損傷后24 h、48 h行同樣濃度的rhEPO處理，無神經(jīng)保護(hù)作用，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表2)。神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變(見圖4)。OGD損傷后立即給予rhEPO處理，存活細(xì)胞數(shù)最多，中間散在皺縮細(xì)胞。而OGD損傷后24 h、48 h給予rhEPO處理，存活細(xì)胞數(shù)少，視野內(nèi)散在大量細(xì)胞碎片。

表1 不同劑量rhEPO對神經(jīng)元存活率的影響

OGD損傷組及rhEPO處理組1、2、3、4與正常對照組相比#P<0.05；rhEPO處理組2、3、4與OGD損傷組相比*P<0.05；rhEPO處理組2與其余各組相比ΔP<0.05

表2 不同時間rhEPO對神經(jīng)元存活率的影響

OGD損傷組及rhEPO處理組與正常對照組相比#P<0.05；rhEPO處理組與OGD損傷組相比*P<0.05

3 討 論

腦卒中是導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因之一。目前腦梗死的治療手段非常有限，在急性缺血性卒中動物模型中超過1000種有效的化合物已經(jīng)開發(fā)出來，但幾乎沒有一個被批準(zhǔn)用于臨床[2]。重組組織型纖溶酶原激活物(recombinant tissue plasminogen activator，rtPA)是目前唯一被批準(zhǔn)在臨床使用的藥物。但rtPA的治療范圍相對狹窄，并非每位患者都適用，且增加了腦出血的風(fēng)險，對白色血栓的治療效果不佳。因此，開發(fā)更安全、更有效的治療方法十分必要。

EPO在中樞神經(jīng)系統(tǒng)是一個很有發(fā)展前景的神經(jīng)保護(hù)劑，其神經(jīng)保護(hù)作用和機(jī)制已經(jīng)被大量研究證實，EPO主要的作用機(jī)制包括抗炎癥反應(yīng)、抗氧化作用、抗神經(jīng)元凋亡、促進(jìn)血管生成等[3,4]。最近一項研究發(fā)現(xiàn)，rhEPO對于白色血栓即血小板血栓誘導(dǎo)的局部缺血性卒中也可以發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[5]。然而，EPO可以促進(jìn)紅細(xì)胞增殖，導(dǎo)致在系統(tǒng)性應(yīng)用EPO時可能產(chǎn)生許多副作用，如血栓形成、高血壓、腫瘤進(jìn)展或癲癇。因此研究EPO的有效劑量及有效作用時間十分必要。

本研究通過建立體外新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元OGD模型，發(fā)現(xiàn)rhEPO(0.1～10 U/ml)可增加OGD損傷的皮質(zhì)神經(jīng)元的存活率，且濃度為10 U/ml時rhEPO神經(jīng)保護(hù)作用最強(qiáng)。當(dāng)rhEPO濃度大于10 U/ml時，rhEPO保護(hù)作用消失。Souvenir R在NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞系分化的神經(jīng)元中，OGD后即給予0 U/ml、3 U/ml、10 U/ml、30 U/ml的rhEPO，發(fā)現(xiàn)10 U/ml的劑量時保護(hù)作用最強(qiáng)，30 U/ml時無神經(jīng)保護(hù)作用[6]。本研究結(jié)果與之大致相同，提示rhEPO對神經(jīng)細(xì)胞的活性可能呈雙向調(diào)節(jié)作用，高濃度EPO可能抑制神經(jīng)細(xì)胞活性，這與我們之前的研究結(jié)果一致[1]。高劑量的EPO喪失神經(jīng)保護(hù)作用可能的機(jī)制為：EPO可以結(jié)合兩種受體，即高親和性的同源二聚體(EPOR/EPOR)和低親和性的異源二聚體(CD131/EPOR)受體。在大多數(shù)非造血細(xì)胞，EPO通過結(jié)合低親和性的異源二聚體受體發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，如CD131基因敲除的小鼠表現(xiàn)出正常的造血功能而缺乏組織保護(hù)作用[7]。另一個證據(jù)是氨基甲酰化的促紅細(xì)胞生成素(carbamylated erythropoietin，CEPO)，一種EPO衍生物，由于其不刺激紅細(xì)胞生成的神經(jīng)保護(hù)作用而引起廣泛關(guān)注。Liu X等通過糖尿病視網(wǎng)膜病變動物模型的研究發(fā)現(xiàn)CEPO通過CD131發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，進(jìn)一步說明EPO通過結(jié)合低親和性的異源二聚體受體發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[8]。高劑量的EPO產(chǎn)生不利影響可能涉及下調(diào)異源二聚體受體，EPOR會增加而相應(yīng)的CD131沒有增加，導(dǎo)致異源二聚體CD131/EPOR的比例下降。同源二聚體EPOR以高親和力與EPO結(jié)合，使EPO介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用減弱或消失[9,10]。另外，Ehrenreich發(fā)現(xiàn)血小板生成素(thrombopoietin，TPO)在神經(jīng)系統(tǒng)可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，由于EPO和TPO的受體結(jié)合區(qū)域結(jié)構(gòu)相似，因此，高濃度的EPO可能與神經(jīng)系統(tǒng)的血小板生成素受體(thrombopoietin receptor，TPOR)結(jié)合，在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)引發(fā)強(qiáng)大的凋亡信號，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11]。

通過實驗我們發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)神經(jīng)元OGD損傷后立即給予rhEPO保護(hù)作用最強(qiáng)，損傷后24 h、損傷后48 h給藥沒有增加皮質(zhì)神經(jīng)元存活率。Gao Y等在沙鼠腦缺血模型中的研究結(jié)果提示10 min～1 h為急性損傷到早期恢復(fù)階段的轉(zhuǎn)變時間，1 d～3 d是從早期恢復(fù)階段到晚期恢復(fù)階段的轉(zhuǎn)變時間，而前者可能是EPO治療的“黃金時間”[12]。一項研究結(jié)果與之相符，在制備新生大鼠腦缺血缺氧模型后分別于0 h、1 h、3 h給予單劑量rhEPO治療，通過比較快速聽覺處理能力和腦室的大小發(fā)現(xiàn)0 h組、1 h組、3 h組的療效依次減弱，其中缺血損傷后立即給予rhEPO療效最明顯，1 h組、3 h組的治療甚至無保護(hù)作用[13]。在該模型中，以往有研究曾發(fā)現(xiàn)腦缺血缺氧損傷6 h～12 h大腦皮質(zhì)、紋狀體、蒼白球、CA1區(qū)的凋亡細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)出高密度分布，而rhEPO腹腔內(nèi)注射后，在腦內(nèi)達(dá)到峰值的時間是腦缺血損傷后10 h，這提示了缺血缺氧損傷后立即腹腔注射單劑量rhEPO，可在大量神經(jīng)元凋亡之前起到保護(hù)作用[14]。以上研究結(jié)果大致相同，但是Reitmeir R等在小鼠腦局部缺血性損傷72 h后開始給予腦室內(nèi)注射EPO 10 U/d直到第30天，發(fā)現(xiàn)EPO也可以明顯改善神經(jīng)功能的恢復(fù)[15]。Cramer SC等[16]在臨床研究中也提出了治療的時間窗，但他認(rèn)為缺血性腦卒中發(fā)病24 h～48 h后接受EPO治療較發(fā)病6 h內(nèi)即開始接受EPO治療的有效性和安全性可能更好，但尚有待證實。以上研究結(jié)果不盡相同，需要更多的實驗研究去探索EPO的作用時間窗。

本研究結(jié)果表明，rhEPO 對急性缺血性腦損傷有明確的治療作用，但目前有關(guān)rhEPO的研究大部分為動物實驗，要實現(xiàn)其臨床應(yīng)用仍需要開展大量臨床試驗。且需要解決如rhEPO的作用時間、有效劑量、安全性等問題，隨著臨床研究的深入，rhEPO有望成為治療急性腦梗死的新方法。希望本研究結(jié)果能為今后臨床應(yīng)用rhEPO治療急性腦梗死提供實驗和理論依據(jù)。

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A：培養(yǎng)4 h；B：培養(yǎng)48 h；C：培養(yǎng)72 h；D：培養(yǎng)7 d

A：陽性細(xì)胞 B：陰性細(xì)胞

A：正常對照組；B：OGD損傷組；C：rhEPO終濃度0.1 U/ml；D：rhEPO終濃度1 U/ml；E：rhEPO終濃度10 U/ml；F：rhEPO終濃度100 U/ml

圖3 不同劑量rhEPO作用下原代皮質(zhì)神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)改變(×200)

Study on protection of erythropoietin on oxygen-glucose deprivation induced injury in primary cultured rat cortical neurons

WANGNi,WANGXiaofang,HAONing,etal.

(DepartmentofNeurologyandNeuroscienceCenter,FirstHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China)

Objective To explore the protective effects of rhEPO against oxygen-glucose deprivation(OGD) in rat primary cortical neurons and the effective dose and duration of action of rhEPO.Methods Cortical neurons of neonatal Wistar rats after 7～11 days’ primary culture were randomly divided into control group,OGD group and rhEPO treatment group.The OGD model of cortical neurons was established.After OGD,cortical neurons were treated with different doses of rhEPO(0.1 U/ml、1 U/ml、10 U/ml、100 U/ml) and were given with 10 U/ml rhEPO on each time point after OGD 0 h,24 h,48 h.The changes of morphology of the cells were observed under microscope.Then detected cells’ survival rate by MTT assay.Results Compared with OGD group,the survival rate of neurons was higher in the rhEPO treatment group (0.1 U/ml、1 U/ml、10 U/ml)(P<0.05).The protection was the most significant when the concentration of rhEPO was 10 U/ml (P<0.05).And the cortical neurons’ survival rate was the highest when given with 10 U/ml rhEPO after OGD immediately(P<0.05).Whereas,the survival rate of cells treated with the same dosage were not increased after OGD 24 h and 48 h.Conclusion Erythropoietin protected neonatal rat cortical neurons against injury induced by oxygen-glucose deprivation.And the effective concentration was 0.1～10 U/ml,of which the dose of 10U/ml was the most effective.Moreover,the protection was the most obvious when cortical neurons was given with 10 U/ml rhEPO after OGD immediately.

Erythropoietin; Cortical Neurons; OGD; Protective Effects

A：正常對照組；B：OGD損傷組；C：OGD損傷后0 h；D：OGD損傷后24 h；E：OGD損傷后48 h

1003-2754(2017)04-0299-05

2016-12-07；

2017-03-30

(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科和神經(jīng)科學(xué)中心，吉林 長春130021)

呂曉紅，E-mail：lvxiaohong.student@ sina.com

R743.3

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