GABAA受體激動劑對AD模型配體門控氯通道的作用

黃玉雕， 王明華， 段 偉， 李明哲， 曹方圓

GABAA受體激動劑對AD模型配體門控氯通道的作用

黃玉雕1， 王明華1， 段 偉1， 李明哲2， 曹方圓3

目的 觀察并分析GABAA受體激動劑蠅蕈醇對GABA激活的配體門控氯通道的作用，為尋找新的抗阿爾茨海默病(AD)藥物提供實驗依據。方法 Aβ1-42誘導海馬神經細胞作為AD細胞模型；通過膜片鉗(Patch clamp)技術在大鼠海馬神經元上記錄配體門控氯通道瞬時外向電流，采用非特異性氯通道阻斷劑(NFA)和無GABA的細胞外液確定該電流成份為瞬時外向氯電流；通過膜片鉗技術觀察GABAA受體激動劑蠅蕈醇對于在大鼠海馬神經元上記錄瞬時外向電流的作用；向AD細胞模型中加入GABAA受體激動劑，采用MTT觀察各組細胞活力。結果 加入GABAA受體激動劑蠅蕈醇后GABA激活氯電流強度增加；加入濃度為1 mmol/L蠅蕈醇的AD模型細胞組存活率為(91.32±3.73)%，略高于未加入蠅蕈醇的模型細胞組，兩組對比P>0.05。結論 GABAA受體激動劑蠅蕈醇對于AD細胞模型具有保護作用。

GABAA受體； 阿爾茨海默病； 配體門控氯通道； 膜片鉗

臨床上對于阿爾茨海默病(AD)的診斷主要是通過尸檢后發現胞外β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積和細胞內的神經元纖維纏結，另外大腦內起到認知和記憶功能作用的區域如大腦皮質和海馬等部分損失了大量的神經元和突觸[1]。本實驗旨在探索GABAA受體在大鼠AD模型中的電生理機制，通過應用膜片鉗技術觀察GABA受體門控氯通道在大鼠AD模型中的電流作用及其調節劑的作用。

1 材料與方法

1.1 AD細胞模型制備 健康SD新生24 h內大鼠，體重約5～8 g。取出海馬并置于冰浴的PBS液中剝離其周圍組織和血管膜；剪成1 mm3的左右組織塊[2]。向組織內加入100%DMEM/F12培養液+0.5%胰酶消化液，37 ℃水浴箱內15 min，隨后加入含20%特級胎牛血清的培養液終止消化；低溫高速離心機1000 r/min離心5 min；重懸計數后以2×106/ml的密度種植于35 mm培養皿內；隨后置于37 ℃，95%O2+5%CO2培養箱中培養6 h～8 h；應用98%NEUROBASAL TM AMediu+2%B27的維持培養液維持培養；每36 h～48 h全量換液。加入濃度為20 μmol/L Aβ1-42溶液培養72 h建立新生大鼠AD細胞模型。

1.2 膜片鉗記錄實驗 采用全細胞膜片鉗技術。硅酸硼玻璃電極充灌電極內液后尖端電阻為2～3 MΩ。在形成電極細胞膜封接前校正液接電位，破膜后補償電容和串聯電阻。吉歐封接，當封接電阻達到2～8 GΩ，即完成巨歐姆封接，負壓破膜穩定后記錄通道電流。GABA配體門控氯離子通道刺激程序為鉗制電壓-60 mV，指令電壓-80～+80 mv，電壓持續時間800 ms，用躍階電壓的變化方式，躍級電壓+20 mv，間隔1 s[3～6]。通過膜片鉗技術在大鼠海馬神經元上記錄配體門控氯通道的瞬時外向電流(transient outward current，Ito)，采用非特異性氯通道阻斷劑(NFA)和無配體GABA的細胞外液確定該電流成份為瞬時外向氯電流。將AD模型細胞分為添加GABA 50 μmol/L組、GABA100 μmol/L組、GABA 200 μmol/L組和GABA 300 μmol/L組。應用膜片鉗技術記錄各組GABA配體門控氯通道記錄瞬時外向電流，隨后向各組以1 mmol/L的濃度添加GABAA受體激動劑蠅蕈醇并記錄其GABA配體門控氯通道記錄瞬時外向電流的變化，每組3～5個。

1.3 MTT法檢測GABAA受體激動劑對于AD細胞模型的作用 原代海馬神經細胞培養5 d進行分組。對照組(A組)為正常培養的海馬原代細胞；實驗1組(B組)為加入濃度為20 μmol/LAβ1-42溶液培養72 h建立新生大鼠AD細胞模型；實驗2組(C組)為加入濃度為20 μmol/LAβ1-42溶液+濃度為1 mmol/L的蠅蕈醇溶液。培養72 h后應用MTT法檢測細胞存活率。向每孔內加入濃度為5 mg/ml MTT液20 μl，調零孔內只加入維持培養液。繼續將其置于95%O2+5%CO2培養箱中培養3～4 h后以扣板法扣除孔內液體，隨后向各孔內加入DMSO150 μl，于37 ℃下震蕩10～15 min以促進其溶解。待藍色結晶充分溶解后將96孔板置于酶標儀上，以570 nm的濾過波長測定各孔的光吸收值(OD值)。以細胞存活率(%)=實驗組OD值/對照組OD值×100%為公式進行計算。各設置3個平行組，最后取其均值進行統計學分析。

2 結 果

2.1 大鼠海馬神經元AD模型細胞配體門控氯通道電流記錄

2.1.1 GABA激活的配體門控氯通道電流的鑒定 采用全細胞膜片鉗技術，應用實驗方法中設計的膜片鉗記錄方法并在細胞外液中添加200 μmol/LGABA記錄到(見圖1A)中的電流，而后在細胞外液中加入了1 mmol/L GABAA受體激動劑蠅蕈醇使電流強度增加，記錄到了(見圖1C)中的電流。記錄到的電流是否為GABA激活的氯通道電流呢？隨后在細胞外液中去除GABA記錄到了(見圖1B)中的電流，電流強度明顯降低；在另一細胞外液添加200 μmol/LGABA記錄到的電流中添加非特異性氯通道阻斷劑NFA 5 min后記錄到了(見圖1D)中的電流，電流強度明顯降低。由于NFA為非特異氯通道阻斷劑，在添加記錄到的電流可能未完全阻斷海馬神經元上的電流(如鉀通道電流、鈉通道電流、鈣通道電流和鈣敏感氯電流等)。由以上結果可推斷實驗中記錄到的電流為GABA激活的氯通道電流。

2.1.2 GABAA受體激動劑對于GABA激活的配體門控氯通道電流的影響 將AD模型細胞分為添加GABA 50 μmol/L組、GABA 100 μmol/L組、GABA 200 μmol/L組和GABA 300 μmol/L組，分別記錄各組及以1 mmol/L的濃度添加GABAA受體激動劑蠅蕈醇后的電流，每組記錄3～5個細胞。電流變化結果(見表1～表4)。

2.2 GABAA受體激動劑對于AD細胞模型作用的MTT檢測結果 經MTT法檢測關于GABAA受體激動劑蠅蕈醇對于AD細胞模型影響的結果顯示，加入蠅蕈醇濃度為1 mmol/L的實驗1組AD模型細胞的存活率為(91.32±3.73)%，與對照組相比P<0.05,具有統計學意義；不加入蠅蕈醇的實驗2組模型細胞存活率為(89.37±3.25)%，與對照組相比P<0.05,具有統計學意義；實驗1組與實驗2組相比P>0.05，無統計學意義(見表5)。

圖1 膜片鉗實驗驗證AD模型細胞GABA激活配體門控氯通道電流

電壓(mV)對照組(pA/pF)加藥組(pA/pF)P值F值t值-80-60-40-20020406080-5.45±1.77-4.10±0.82-2.98±2.31-1.35±2.620.27±1.431.87±0.773.35±0.674.79±0.746.15±1.04-14.53±1.46**-9.86±1.35**-6.02±1.07*-2.56±0.590.84±0.313.96±0.68**6.94±1.23**10.15±2.06**13.21±1.77**<0.001<0.0010.0290.3470.4060.002<0.0010.0010.0018.8528.1586.04915.31544.4910.0520.9776.234.8487.6321.3412.6640.998-0.876-4.567-5.735-5.472-5.328

與對照組相比*P<0.05,具有統計學意義；**P<0.01，具有顯著統計學意義

表2 GABA 100 μmol/L組添加GABAA受體激動劑蠅蕈醇前后電流變化結果

與對照組相比*P<0.05，具有統計學意義；**P<0.01，具有顯著統計學意義

表3 GABA 200 μmol/L組添加GABAA受體激動劑蠅蕈醇前后電流變化結果

與對照組相比*P<0.05，具有統計學意義；**P<0.01，具有顯著統計學意義

表4 GABA 300 μmol/L組添加GABAA受體激動劑蠅蕈醇前后電流變化結果

與對照組相比*P<0.05，具有統計學意義；**P<0.01，具有顯著統計學意義

表5 各組阿爾茨海默病模型細胞存活率結果(%)

與對照組相比*P<0.05，具有統計學意義；實驗2組與實驗1組相比P>0.05，無統計學意義

3 討 論

AD患者的基底前腦膽堿能神經元、腦干去甲腎上腺素和五羥色胺能神經元及海馬谷氨酸能細胞群特別容易受到損傷，而調節這些興奮性系統的動態平衡主要是通過GABA介導的GABAA受體的抑制作用。AD患者GABAA受體相對較少，其可能的原因是GABAA受體的特殊亞基成分在疾病發展過程中發生改變，大量基礎及臨床實驗證實GABA能神經遞質系統參與AD的發生和發展并已確定GABA受體與AD的神經退行性變相關[7～10]。

有學者通過膜片鉗技術記錄了缺氧后神經元的GABA配體門控氯通道的全細胞電流，認為GABAA受體的功能與L型電壓依賴鈣通道密切相關，L型電壓依賴鈣通道被激活后Ca2+內流增加進而引起GABAA受體發揮作用[3]。L型鈣通道的阻斷劑尼莫地平廣泛應用于腦缺血的臨床治療，具有改善腦血管的血液循環和腦保護的作用，但治療效果不佳；同時在腦缺血治療中，興奮性氨基酸受體阻斷劑和自由基清除劑等腦保護藥物也被廣泛應用與臨床，但其效果均不理想。而GABA門控氯通道與鈣通道這種密切的關系，以及GABA受體激動劑的神經保護作用，使我們推測這將會是一種大有潛力的神經保護機制[11,12]。Zhou等通過對GABA門控氯通道電生理研究肯定了雙(7)-他克林治療AD的有效性,證實了GABAA受體這種配體門控氯通道發揮作用與細胞內外的離子濃度和電流方向密切相關[13]。受以上研究的啟發，本實驗旨在探索GABAA受體在AD中的電生理機制，為AD的治療提供新的靶點。

為研究GABAA受體激動劑對于AD細胞模型作用，本實驗中采用全細胞膜片鉗技術記錄GABA激活的氯通道電流，應用NFA和無配體GABA的細胞外液以確定記錄到的電流成份為GABA激活的瞬時外向氯電流。由于NFA為非特異氯通道阻斷劑，在添加記錄到的電流可能未完全阻斷海馬神經元上其他電流如鉀通道電流、鈉通道電流、鈣通道電流和鈣敏感氯電流等，其可能成為影響記錄到的GABA激活瞬時外向氯電流真實性的因素之一。確定電流成分后將AD模型細胞以添加GABA濃度的不同將其分成4組，記錄各組電流后以1 mmol/L的濃度添加GABAA受體激動劑蠅蕈醇后的電流，每組記錄3～5個細胞。通過對結果的分析顯示添加GABAA受體激動劑蠅蕈醇后，各組記錄的電流顯著增加。GABA為抑制性遞質，GABAA受體激動劑可以增強GABA與GABAA受體結合，更強的發揮其抑制作用。其抑制作用可能減少AD患者基底前腦膽堿能神經元、腦干去甲腎上腺素神經元和五羥色胺能神經元及海馬谷氨酸能細胞群受到損傷，從而發揮其保護作用。

另外本實驗中應用GABAA受體激動劑蠅蕈醇體外添加后繼續培養的方式探討GABAA受體激動劑對于AD細胞模型作用，經MTT法檢測實驗各組細胞存活率。統計結果顯示加入蠅蕈醇濃度為1 mmol/L的實驗1組和不加蠅蕈醇的實驗2組的AD模型細胞的存活率分別為(91.32±3.73)%和(89.37±3.25)%，經統計學分析發現實驗1組與實驗2組相比P>0.05，無統計學意義，但實驗1組細胞存活率高于實驗2組。如上所述原代海馬神經元體外培養細胞減少的主要方式包括主動性凋亡和繼發性壞死兩種，在對照組與實驗組培養環境、條件和方法相同情況下可相對排除主動性凋亡因素。結合上述膜片鉗的研究結果考慮GABAA受體激動劑對于AD細胞模型具有保護作用，可設想GABAA受體激動劑可參與AD的發病機制，對于阿爾茨海默病具有保護作用。

綜上所述，GABAA受體激動劑蠅蕈醇對于SD大鼠AD細胞模型具有保護作用，同時對于AD進程的抑制性作用。由以上結果可推斷GABAA受體對于改善及治療AD的認知功能障礙有潛在的治療作用，從而改善AD患者治療效果不佳的窘境。

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The role of GABAA receptor agonist for the ligand-gated chloride channels in the model of Alzheimer’s disease

HUANGYudiao,WANGMinghua,DUANWei,etal.

(DepartmentofNeurology,the5ndAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Daqing163319,China)

Objective To observe and analyze the role of the GABAAreceptor agonist muscimol on the GABA-activated ligand gated chloride channel,in order to provide experimental basis for finding new anti-Alzheimer’s disease drugs.Methods Add Aβ1-42to induce the hippocampal neurons as Alzheimer’s disease cell model.Record the transient outward current of ligand-gated chloride channel in rat hippocampal neurons by the technique of patch clamp.Then use non-specific chloride channel blockers (NFA) and non-GABA extracellular fluid to determine the currents recorded in was the transient outward chloride current.Through patch-clamp technique to observe the role of the GABAAreceptor agonist muscimol for the transient outward currents in the cell model of Alzheimer’s disease.Add GABAAreceptor agonist to the cell model of Alzheimer’s disease and observe the cell viability of each group by the method of MTT.Results The GABA-activated chloride current intensity was increased by adding the GABAAreceptor agonist of muscimol.The survival rate of the rats cell in model of Alzheimer’s disease was (91.32±3.73)% by adding a concentration of 1mmol/L muscimol,it was slightly higher than the model cell group without muscimol,the compared result of two groups wasP>0.05.Conclusions The GABAA receptor agonist of muscimol has protective effect for the rats cell model of Alzheimer’s disease.

GABAAreceptor; Alzheimer’s disease; Ligand-gated chloride channels; Patch clamp

1003-2754(2017)04-0308-04

2016-12-07；

2017-03-30

(1.哈爾濱醫科大學附屬第五醫院神經內科，黑龍江 大慶 163319；2.哈爾濱醫科大學附屬第五醫院，黑龍江 大慶 163319；3.哈爾濱醫科大學(大慶)基礎醫學院形態實驗中心，黑龍江 大慶 163319)

曹方圓，E-mail:1554293985@qq.com

R749.1

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