燈盞細辛注射液對動脈粥樣硬化家兔炎癥反應的影響

蘇 懿， 蔡海榮， 黃永蓮， 黃鉅明

燈盞細辛注射液對動脈粥樣硬化家兔炎癥反應的影響

蘇 懿1， 蔡海榮1， 黃永蓮2， 黃鉅明3

目的 觀察燈盞細辛注射液對動脈粥樣硬化家兔炎癥反應的抑制作用，探討其抑制動脈粥樣硬化的機制。方法 健康SD雄性家兔隨機分為對照組和模型組，模型組采用高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合耳緣靜脈注射小牛血清白蛋白方法建立動脈粥樣硬化模型，飼養(yǎng)10 w后，隨機抽取6只進行病理形態(tài)學檢測，明確動脈粥樣斑塊形成。然后把模型組隨機分為高脂組(100 g/d)和燈盞細辛組[5 ml/(kg·d)腹腔注射]。實驗10 w、18 w取血清，ELISA法測定血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、C-反應蛋白(CRP)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的水平，組織形態(tài)學方法分析動脈粥樣硬化斑塊情況。結(jié)果 第10周，高脂組和燈盞細辛組血清TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1水平明顯高于對照組，動脈粥樣硬化斑塊明顯形成;第18周，燈盞細辛組血清TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1水平明顯低于高脂組，動脈粥樣斑塊明顯減輕。結(jié)論 燈盞細辛注射液具有抑制、延緩動脈粥樣硬化斑塊進展的作用，可能與降低TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1的分泌有關(guān)。

動脈粥樣硬化； 家兔； 燈盞細辛注射液； 炎癥反應

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一組稱為動脈硬化的血管病中常見而最重要的一種，其最主要的病理特征是動脈管壁增厚變硬，失去彈性和官腔縮小，最終發(fā)展為腦梗死、心肌梗死等心腦血管疾病，預后不佳。心腦血管疾病具有發(fā)病率高、致死率高、致殘率高的特點，已經(jīng)成為我國乃至全球死亡的主要原因[1]。動脈粥樣硬化是心腦血管疾病獨立的危險因素，積極干預動脈粥樣硬化對防治心腦血管疾病具有重要的意義。動脈粥樣硬化屬于中醫(yī)學“瘀血”、“痰濁”等范疇[2]，燈盞細辛注射液由燈盞細辛提取而成，具有活血化瘀、通絡止痛的作用，臨床廣泛應用于心腦血管疾病，療效顯著。研究結(jié)果表明，燈盞細辛注射液可以降低腦梗死的死亡率[3]、冠心病的死亡率[4]，改善不穩(wěn)定型心絞痛的療效和癥狀[5，6]，但其機制尚未闡明。為探討燈盞細辛注射抑制動脈粥樣硬化的作用和機制，本實驗復制了家兔動脈粥樣硬化模型[7～9]，并用燈盞細辛注射液進行干預，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料 健康新西蘭雄性家兔36只，體重在2.5～3.0 Kg之間，平均體重為(2.7±0.5)Kg，由廣州花都東信華實驗動物有限公司提供[許可證號為SYXK(粵)2014-0023]。小牛血清白蛋白(廣州瑞舒生物科技有限公司)，燈盞細辛注射液(云南生物谷藥業(yè)股份有限公司，批號：20090641)，普通飼料(廣東醫(yī)學實驗動物中心)，高脂飼料(膽固醇2%、豬油5%、0.2%丙基硫氧嘧啶、蛋黃5%、89.8%的普通飼料，由廣東醫(yī)學實驗動物中心養(yǎng)殖場配制生產(chǎn))。

1.2 動脈粥樣硬化模型建立 所有家兔均在造模前給予普通飼料適應性喂養(yǎng)7 d，待其代謝狀態(tài)穩(wěn)定后隨機分為對照組(n=12)、模型組(n=12)和燈盞組(n=12)，每只分籠喂養(yǎng)。模型組和燈盞組在分組后第一天經(jīng)耳緣靜脈注射小牛血清白蛋白溶液(250 mg/Kg+生理鹽水10 ml)，而對照組一次性經(jīng)耳緣靜脈注射等量的生理鹽水10 ml。隨后對照組給予普通飼料喂養(yǎng)(100 g/d)，模型組和燈盞組給予高脂飼料喂養(yǎng)，兩組日進食量相等(100 g/d)，共喂養(yǎng)10 w。10 w后每組隨機選取家兔2只，經(jīng)耳緣靜脈空氣栓塞致死后取髂外動脈2 cm后經(jīng)光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察明確動脈斑塊形成。隨后，對照組繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)(100 g/d)、模型組和燈盞組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)(100 g/d)，同時燈盞組經(jīng)腹腔注射燈盞細辛注射液(5 ml/kg/d)，而對照組和模型組經(jīng)腹腔注射生理鹽水(5 ml/kg/d)。繼續(xù)共喂養(yǎng)8 w。

1.3 觀察指標

1.3.1 實驗室指標 采血前禁食不禁飲10 h，分別在實驗前、10 w、18 w經(jīng)家兔耳緣靜脈取血，運用ELISA法檢測血清TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1水平(由金域醫(yī)學檢驗中心有限公司按照試劑盒說明書步驟進行檢測)。

1.3.2 組織形態(tài)學觀察 經(jīng)耳緣靜脈空氣栓塞致死后，立即開服取左側(cè)髂外動脈2 cm，先2.5%戊二醛，磷酸液緩沖液沖洗，1%鋨酸固定，石蠟切片，HE染色，光學顯微鏡和電子顯微鏡檢測。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件

2 結(jié) 果

2.1 血清TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1水平的變化 10 w時，對照組家兔血清TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1水平明顯低于模型組和燈盞組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P均﹤0.05)；模型組和燈盞組之間經(jīng)統(tǒng)計學分析，差異無統(tǒng)計學意義(P﹥0.05)。18 w時，對照組血清TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1水平低于模型組和燈盞組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P均﹤0.05)；模型組家兔血清TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1水平明顯高于燈盞組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P均﹤0.05)(見表1)。

2.2 病理形態(tài)學觀察

2.2.1 各組病理形態(tài)學改變 家兔髂外動脈病理切片結(jié)果示：18 w時，對照組家兔可見血管內(nèi)膜的內(nèi)彈性膜、中膜的彈力纖維和外膜的疏松結(jié)締組織。高脂組家兔可見中膜平滑肌細胞增生明顯，管壁明顯增厚，血管內(nèi)皮細胞下聚集了大量泡沫細胞，形成一個動脈粥樣硬化斑塊。燈盞細辛組圖中血管內(nèi)皮細胞下有少量泡沫細胞形成，中膜平滑肌細胞增生，平滑肌細胞中可見脂肪小泡，未見明顯斑塊形成，AS病變較高脂組明顯減輕(見圖1)。

2.2.2 各組組織超微結(jié)構(gòu)改變 家兔髂外動脈病理組織超微結(jié)構(gòu)結(jié)果示：18 w時，對照組圖中可見一橫切的平滑肌細胞，細胞核呈橢圓形，胞漿中可見密體和線粒體等結(jié)構(gòu)，未見明顯病理改變。高脂組家兔可見平滑肌細胞核周圍有大量脂滴小泡，在細胞膜下可見吞飲小泡，胞漿中可見密體等結(jié)構(gòu)，細胞核外形不規(guī)則，核中常染色質(zhì)較多，異染色質(zhì)聚集在核膜周邊，在細胞周圍可見增生的膠原纖維，AS病變明顯。

燈盞細辛組圖中可見一平滑肌細胞，胞漿中可見線粒體和密體等結(jié)構(gòu)，有少量脂滴小泡，細胞和周圍平滑肌細胞聯(lián)系不太緊密，結(jié)締組織增生輕微。AS病變較高脂組明顯減輕(見圖2)。

表1 各組家兔TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1水平的變化

與對照組相比*P<0.05；與高脂組相比#P<0.05

3 討 論

動脈粥樣硬化是多種心腦血管疾病共同的病理基礎，主要累及大動脈(如主動脈、頸動脈和髂動脈)和中動脈(如冠狀動脈和腦動脈)，初期血管壁出現(xiàn)脂質(zhì)條紋，并發(fā)展為纖維斑塊，最終發(fā)展為心腦血管疾病。AS是一種由多種因素引起的疾病[10]，發(fā)病機制復雜，其關(guān)于動脈粥樣硬化發(fā)病機制學說較多，而得到較大范圍認可的是損傷反應學說。損傷反應學說[11～13]認為各種危險因素對動脈內(nèi)皮的損傷和脂質(zhì)在動脈內(nèi)膜層的聚集，導致動脈壁的炎癥反應，逐漸形成粥樣斑塊。動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥反應性疾病，炎癥反應貫穿于動脈粥樣硬化的各個階段，是動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生、發(fā)展和最終形成不穩(wěn)定斑塊的基礎。動脈粥樣硬化炎癥反應可以分為急性炎癥反應和慢性炎癥反應。

在動脈粥樣硬化的早期[14]，高血壓、糖尿病、吸煙、肥胖等心腦血管疾病的危險因子損傷血管內(nèi)皮，致血清低密度脂蛋白進入并滯留在動脈內(nèi)膜，進而被氧化修飾。氧化LDL分子誘導內(nèi)皮表達分泌粘附因子并刺激單核細胞聚集到內(nèi)膜，然后單核細胞在MCP-1的趨化作用下進入動脈內(nèi)壁并分化成巨噬細胞，稀釋細胞吞噬氧化LDL形成泡沫細胞。同時各種因素包括血流切應力的湍流、糖化終末產(chǎn)物、一氧化氮、免疫復合物等引起內(nèi)皮細胞發(fā)生炎癥反應，刺激巨噬細胞分泌多種炎癥介質(zhì)和生長因子，包括腫瘤壞死因子、白介素，促進斑塊的生長和炎癥反應，形成惡性循環(huán)。

在動脈粥樣斑塊的晚期階段，血管內(nèi)皮中白細胞介素含量豐富，其可以活化巨噬細胞，導致血管慢性修復反應[15]。當血液循環(huán)中各種炎癥介質(zhì)明顯增多，可以加快斑塊的進程，刺激巨噬細胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，MMP可以降解纖維帽，導致斑塊不穩(wěn)定、斑塊碎裂，同時炎癥因子可以激活凝血進程，促進血小板等聚集，致斑塊破裂、血栓形成，最終發(fā)生為腦卒中、冠心病等心腦血管疾病[16,17]。

TNF-α 具有誘導細胞凋亡、促進巨噬細胞生成、誘導粘附因子分泌、促進血管新生、血栓形成、使斑塊不穩(wěn)定等作用，是AS病變過程中重要的炎癥因子[18]。MCP-1具有活化巨噬細胞等炎癥反映細胞聚集，誘導AS形成的作用。CRP可以損傷內(nèi)皮細胞，刺激其表達炎癥因子和抑制其修復，從而促進AS形成。IL-6可以導致內(nèi)皮損傷，促進單核巨噬細胞遷移形成巨噬細胞，激活凝血功能促進血栓形成，誘導AS形成高脂喂養(yǎng)聯(lián)合靜脈注射小牛血清白蛋白是建立AS經(jīng)典的動物實驗模型[19]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂喂養(yǎng)聯(lián)合耳緣靜脈注射小牛血清白蛋白可以使家兔血清TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1水平升高，并形成動脈粥樣斑塊，升高成功建立了AS模型。而燈盞細辛注射液可以降低動脈粥樣硬化家兔血清TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1水平，并且可以使血管內(nèi)壁的纖維斑塊縮小，延緩AS斑塊的進展。

綜上所述，燈盞細辛注射液可能通過降低血清TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1水平，調(diào)節(jié)免疫炎癥反應，從而發(fā)揮抑制動脈粥樣硬化的作用。

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The effects of Dengzhanxixin injection on inflammation in atherosclerosis rabbit Model

SUYi，CAIHairong，HUANGYonglian，etal.

(FoshanHospitalofTraditionalChineseMedicine，F(xiàn)oshan528000,China)

Objective To observe the effects of Dengzhanxixin injection on inflammation in experimental atherosclerosis rabbits and explore its possible mechanism.Methods The healthy male SD rabbits were randomly divided into normal control group and the model group.The model group established an atherosclerosis model by feeding high-fat diet plus injecting bovine serum albumin in rabbits.Then twenty rabbites of the model group were randomly divided into high-cholesterol group (100 g/d) and the Dengzhanxixin group[5 ml/(kg·d) by intraperitoneal injection].The plaque of left iliac artery was performed with histomorphometry analysis.Serum TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1 were detected with standard enzymatic assays.Results At 10 weeks,the levels of TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1 in the high-cholesterol group and the Dengzhanxixin group were significantly higher than those in the control group,tatherosclerotic plaques was formed.At 18 weeks,the levels of TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1 in the Dengzhanxixin group were significantly lower than those in the high-cholesterol group,and the plaques were reduced significantly.Conclusion The study suggests that Dengzhanxixin injection could decrease atherosclerosis in atherosclerotic rabbit model by decreasing the secretion of TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1.

Atherosclerosis； Rabbits； Dengzhanxixin injection； Inflammation

A：對照組 B：高脂組 C：燈盞細辛組

A：對照組 B：高脂組 C：燈盞細辛組

1003-2754(2017)04-0342-04

2016-12-13；

2017-01-30

(1.佛山市中醫(yī)院，廣東 佛山 528000；2.深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳 518172；3.廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 廣州 510800)

蔡海榮，E-mail：chr153426@126.com

R743.1

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