青枯雷爾氏菌拮抗放線菌的篩選及其抗菌活性物質的分離

羅文建，劉雨虹，施河麗，譚 軍，王 瑞，趙秀云，向必坤*

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青枯雷爾氏菌拮抗放線菌的篩選及其抗菌活性物質的分離

羅文建1，劉雨虹1，施河麗2，譚 軍2，王 瑞2，趙秀云1，向必坤2*

（1.華中農業大學農業生命科學技術學院，武漢 430070；2.湖北省煙草公司恩施州公司，湖北恩施 445000）

煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌引起的土傳性病害。從健康土壤中分離到對青枯雷爾氏菌具有明顯拮抗作用的放線菌LC-7，經初步鑒定為鏈霉菌屬（sp.）。鏈霉菌LC-7的發酵液用氯仿、正丁醇萃取后，通過捷克八溶劑系統分析，判定該抗菌物質為堿性水溶性抗生素。抗菌物質進一步采用離子交換樹脂純化，并經醇沉后，獲得抗生素的結晶，再用HPLC進一步純化后并進行質譜分析可得出，LC-7所產抗菌活性物質為一種新的氨基糖苷類抗生素，其分子量為365.1。田間試驗表明，鏈霉菌LC-7對煙草青枯病具有顯著的防治效果，防效為85.48%。

放線菌；青枯雷爾氏菌；氨基糖苷類抗生素；分離純化

煙草青枯病是細菌性土傳性病害，由青枯雷爾氏菌（）引起。其寄主及危害范圍廣泛，造成了巨大的經濟損失[1]。篩選有效的生防菌對青枯病進行防治是煙草生產的迫切需要。近年來有許多拮抗細菌如放線菌、芽胞桿菌、假單胞桿菌等被應用到煙田中防治青枯病[2]，能有效控制植物病害的放線菌主要是鏈霉菌屬[3]。放線菌一方面通過寄生于植物組織內誘導產生抗生素對致病菌發揮生防作用[4]，另一方面可以通過抗生作用[5]、競爭作用、重寄生和捕食作用[6]降低病原菌的致病性和侵染性，從而達到防治的效果。本研究擬從健康煙田土壤中篩選出對青枯病菌具有良好抗性的放線菌，并選取抑菌活性最高的菌株進行鑒定，對其所產生的活性物質進行分離、純化與鑒定，為開發新型高效綠色生防菌劑及抗生素提供技術和物質支持，以豐富煙草青枯病生物防治的藥劑和方法，改善煙草青枯病生防藥劑單一的現狀。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌

煙草青枯雷爾氏菌（），從發病煙草植株上分離，為本實驗室保存。

1.2 土壤樣品的采集

采集地：湖北恩施州健康煙田。

1.3 放線菌的分離和純化

1.3.1 土壤放線菌的分離 從恩施州健康煙田中采集煙草根際土壤，稱取5 g土樣放于含15~20個小玻璃珠無菌三角瓶中，加入45 mL無菌水后室溫下振蕩20 min，將所得土壤浸液按梯度稀釋，最后取100 μL濃度為10-2~10-4的土壤浸液，均勻地涂布于含有50 μg/mL重鉻酸鉀的高氏一號培養基平板上，28 ℃下培養5 d。挑取平板上的單菌落保存。

1.3.2 目的生防放線菌的篩選 將分離所得的放線菌單菌落點接至PDA平板中央，于28 ℃培養3 d，然后將培養至對數期的青枯雷爾氏菌噴霧至放線菌長好的平板上。28 ℃培養24 h后，觀察抑菌圈直徑大小。

1.3.3 放線菌的鑒定 對檢測到具有顯著抗菌活性的一株放線菌LC-7進行16S rRNA和形態鑒定。取其48 h培養液，用常規方法提取放線菌的基因組DNA，以16S rRNA的通用引物進行PCR[7]，正向引物：F 5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，反向引物：R 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′。PCR反應體系為：ddH2O 19 μL，10×PCR緩沖液 2.5 μL，正反引物各1 μL，dNTP 1 μL，Taq酶 0.5 μL。程序為：94 ℃變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環；72 ℃延伸8 min。PCR產物純化后，交上海生工公司測序。

1.3.4 田間試驗 2015年在宣恩縣椒園鎮涼風村開展田間試驗。該試驗地歷年種植煙草，青枯病發生嚴重，土壤屬黃棕壤，肥力中等，地勢平坦，光照條件較好，海拔850 m。供試品種為云煙87。

將放線菌LC-7接種到PDA培養基中于28 ℃，180 r/min搖床培養120 h，獲得發酵液。試驗共設置3個處理：處理1，72%硫酸鏈霉素稀釋1000倍后淋灌煙株，每株煙草灌200 mL；處理2，放線菌LC-7發酵液稀釋50倍后淋灌煙株，每株煙苗灌根200 mL；處理3，CK，灌清水200 mL/株。每個處理3個小區，每小區栽60棵煙。各處理在移栽后10、30和50 d進行根部灌淋，移栽后60 d調查各處理青枯病的發病情況，并計算發病率、病情指數、相對防效。煙草青枯病的調查方法參照中華人民共和國國家標準GB/T 3222—2008[8]。

1.4 LC-7抗菌活性物質的分離純化

1.4.1 發酵液的萃取 使用高氏一號培養基[9]培養放線菌LC-7菌株48 h，過濾去除發酵液中的雜質和菌體。將發酵液分別用氯仿、正丁醇等體積萃取3次，并將萃取相與萃余相分別在50 ℃條件下，旋轉蒸干，加純水溶解，測定其抗菌活性[10]。以青枯雷爾氏菌為檢定菌，點樣10 μL于直徑5 mm濾紙片上，測定抑菌圈直徑大小。

1.4.2 捷克八溶劑系統分析 采用Doskochilova溶劑系統[11]，層析試驗在玻璃試管（0.25 cm×20 cm）中進行，采用上行展層，取正丁醇萃余相，點樣量5 μL。待溶劑到達濾紙前沿，取出晾干。用生物學顯跡法把層析紙條貼于瓊脂平板上，使紙上相應部位的組分擴散滲入到培養基中，將青枯雷爾氏菌均勻噴灑至平板上，于28 ℃培養24 h后，觀察結果并測比移值（f），重復3次。

1.4.3 陽離子交換柱層析 732陽離子樹脂按照文獻[12]的方法轉為Na＋型裝柱。上樣樣品為正丁醇萃余相。

洗脫：用2~6%氨水梯度洗脫，分段收集洗脫液。將洗脫液50 ℃蒸干，純水重溶。用濾紙片法檢測各段洗脫液的抗菌活性，收集保留具有抗菌活性的組分A。

1.4.4 陰離子交換柱層析 201×4陰離子交換樹脂按照文獻[12]的方法轉為OH–型裝柱。上樣樣品為1.4.3中得到的組分A。將得到的各段洗脫液50 ℃分別真空旋轉蒸干，純水重溶。用濾紙片法檢測各段洗脫液的抗菌活性。收集保留具有抗菌活性的組分B。

1.4.5 結晶 將1 mL經過離子交換純化后的B組分用2 mol/L H2SO4調至pH 8.5（pH值經預試驗確定），然后按1:1的體積比加入無水乙醇，振蕩混勻后置于4 ℃靜置1 h，醇沉，12，000 r/min離心5 min，收集上清液，沉淀分別用95%和75%的乙醇洗滌1次，離心。收集并合并3次離心的上清液，混勻，室溫靜置15 min，待晶體析出。棄上清，將晶體晾干，加入100 μL純水重溶。使用濾紙片法驗證晶體的活性，以青枯雷爾氏菌為檢定菌。

1.5 抗菌活性物質的HPLC純化和質譜鑒定

1.5.1 高效液相色譜法 采用反相高效液相色譜法對純化得到的抗生素樣品進行分析。采用C18反相柱，檢測波長為210 nm，流速為1.0 mL/min，分別用4種不同流動相進行分析：①5%~100%乙腈；②0.02 mol/L三氟醋酸溶液-甲醇（95:5）；③0.02 mol/L三氟醋酸溶液-丙酮（9:1）；④5%~100%甲醇。

1.5.2 質譜鑒定與分析 將結晶后的樣品用1 mL純凈水重溶，使用安捷倫公司HPLC-Q-TOF MS 1260/G6540A正離子模式進行檢測，離子源參數為氣體溫度350 ℃，氣體流速9 L/min，霧化器壓力為0.2756 MPa，參比質核比（）為121.0509和922.0098，質譜檢測范圍100~1700/，采集速率1.5 spectra/s。HPLC使用安捷倫C18反相柱（RR 2.1×100 mm 3.5-Micron），進樣量1 μL，流動相為5%乙腈，流速為0.3 mL/min。

2 結 果

2.1 拮抗放線菌的分離

從土壤中經稀釋涂布法[13]，共分離得到20株放線菌，在大多數放線菌單菌落周圍有明顯的抑菌圈存在。根據抑菌圈的大小可以判斷菌種對青枯雷爾氏病菌的抑菌效果，篩選到一株抑菌效果較好的放線菌LC-7，抑菌圈直徑可達60 mm（圖1）。

2.2 LC-7的菌落形態及其孢子微觀形態

放線菌LC-7生長初期為白色，孢子產生后呈淡紫色（圖2A）。采用插片法觀察放線菌自然生長狀態，可見放線菌LC-7的氣生菌絲和基內菌絲（圖2B）。其孢子絲的形狀為直形，孢子是桿狀，其表面為褶皺狀（圖2C）。

圖1 拮抗放線菌LC-7抑制青枯雷爾氏菌的生長

A 菌落形態????????B 菌絲形態????????C 孢子形態

2.3 放線菌16S rRNA分析

測序結果表明，放線菌LC-7的16S rRNA基因序列與弗氏鏈霉菌（subsp. acinicolor）的16S rRNA gene同源性為98%，與酒紅土褐鏈霉菌（strain FX-139）的16S rRNA gene同源性為97%，測序比對序列確定該菌株屬于鏈霉菌屬（），命名為鏈霉菌LC-7菌株（sp. LC-7）（圖3）。

圖3 放線菌LC-7的系統發育樹

2.4 放線菌LC-7對煙草青枯病的防治效果

田間試驗結果見表1。通過田間試驗驗證，鏈霉菌LC-7防治煙草青枯病效果較好，顯著降低了青枯病的發病率和危害程度，對青枯病的防效達到了85.48%，明顯優于硫酸鏈霉素。

表1 田間試驗放線菌對煙草青枯病的防效

2.5 抗菌物質的分離純化

2.5.1 發酵液的萃取 鏈霉菌LC-7發酵液用氯仿、正丁醇進行等體積萃取，并分別檢驗萃取相與萃余相的抗菌活性，結果顯示，氯仿和正丁醇的萃取相都無活性，萃余相則有明顯的抗菌活性（圖4）。由相似相溶原理可知，氯仿萃取非極性物質，正丁醇萃取的物質極性較大。經過驗證氯仿和正丁醇萃余相抑菌活性較強，萃取相活性較弱。說明活性物質主要存在于萃余相，萃取可以去除發酵液中一部分親水和親脂的雜質。保留萃余相進一步分離純化。

2.5.2 捷克八溶劑系統紙層析確定抗生素的類別 在捷克八溶劑系統紙層析中，由于各類抗生素的酸堿性、極性和溶解度的不同，其在不同溶劑系統呈現的f值也不相同[14]。根據f值所作曲線圖譜特征可以初步判定被分析物質的類別。如圖5所示，LC-7產生的抗菌物質（正丁醇萃余相）在溶劑系統5和6中f值較大，在其他系統中f值較小，其f值的連線類似帆船，推斷此類活性物質屬于氨基糖苷類抗生素，典型代表如鏈霉素、卡那霉素等[11]。

A????????????B

圖5 捷克八溶劑系統圖譜

2.5.3 離子交換柱層析的分離及結晶 發酵液萃余相經陽離子和陰離子交換柱層析純化和濃縮后，色素顯著減少，由原來的淡黃色變為無色。用H2SO4調節濃縮液的pH，經醇沉后得到晶體。晶體經純水重溶后通過抑菌試驗證實，具有強烈的抑菌活性（圖6）。

2.6 抗菌活性物質的HPLC純化和質譜鑒定

將晶體以純水溶解，用高效液相色譜法對樣品進行純度分析。洗脫開始后3 min左右出峰，5 min左右出峰結束，之后沒有其他峰出現（圖7A）。收集樣品后進行質譜分析，發現該抗生素的分子量為365.1（圖7B）。

A????????????B???????????? C

注：A. 陽離子樹脂純化后樣品抗菌活性的檢測：a.陽離子樹脂純化后的樣品，b.正丁醇萃余相，c.發酵原液。

B. 陰離子樹脂純化后樣品抗菌活性的檢測：a. 陰離子樹脂純化后的樣品，b.正丁醇萃余相，c.發酵原液。C. 結晶。

圖6 離子交換層析純化活性物質及結晶

Fig. 6 Ion exchange chromatography purification of active substances and crystallization.

3 討 論

放線菌可產生多種抗生素，對多種植物病原細菌和真菌都具有較強的抑制作用[15]。目前，人們從土壤中篩選了多株能抑制青枯雷爾氏菌的放線菌。例如，從健康煙田土壤分離出婁徹氏鏈霉菌()，與其他生防菌劑連同有機肥一起施用于田間時，可通過控制土壤微生物區系的結構來控制青枯病[16]。陸錚錚等[17]從煙草根圍土壤中篩選出3株拮抗放線菌：玫瑰暗黃鏈霉菌（）、橄欖綠鏈霉菌（）和黃麻鏈霉菌（）。熊仕俊等[18]篩選出3株對番茄青枯病菌拮抗效果較好的放線菌：鮮黃鏈霉菌（galbus）、栗褐鏈霉菌（）和酸瘡痂鏈霉菌（）。龍克啟等[19]篩選出拮抗辣椒青枯菌的淡紫灰鏈霉菌（）。弗吉尼亞鏈霉菌（）菌株 Y30 和 E36在盆栽試驗中能顯著抑制番茄青枯病的發生[20]。農用鏈霉素在田間防治效果不甚理想，且單一抗生素類物質的長期使用，易導致青枯雷爾氏菌產生耐藥性。

本研究篩選得到1株抑菌效果明顯的鏈霉菌LC-7，對其產生的抑菌活性物質進行了分離純化與結構鑒定，發酵液預處理除去菌體等雜質后，用氯仿、正丁醇萃取，去除雜蛋白和一些雜質。考慮到氯仿毒性較大，因此后續純化均用正丁醇萃余相。用離子交換層析進一步純化，將純化后的物質進行結晶，晶體重溶后具有抑菌活性。抗菌活性物質的分子量為365.1，是一類新型氨基糖苷類抗生素。氨基糖苷類抗生素含有豐富的氨基和環醇，性質穩定，水溶性好，代表抗生素有鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素等。產氨基糖苷類抗生素的微生物多數為鏈霉菌（）和小單孢菌()[21]。

通過田間試驗驗證，鏈霉菌LC-7防治煙草青枯病效果好，為煙草青枯病的生物防治提供了新的藥劑。

4 結 論

鏈霉菌LC-7產生的抑菌活性物質對青枯雷爾氏菌具有顯著的抑制作用，對其進行了分離純化與結構鑒定后，判斷該活性物質屬于一類新型的氨基糖苷類抗生素，分子質量為365.1，在微生物農藥方面具有發展潛力。

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The Selection of AntagonisticActinomycetes againstand Purification of Antibacterial Substance

LUO Wenjian1, LIU Yuhong1, SHI Heli2, TAN Jun2, WANG Rui2, ZHAO Xiuyun1, XIANG Bikun2*

(1. College of Life Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2. Enshi Tobacco Company of Hubei Province, Enshi, Hubei 445000, China)

Tobacco bacterial wilt is a soil-borne disease caused by. A strain ofLC-7 with obvious antagonistic activities againstwas isolated from healthy soils and identified assp. The fermentation broth ofsp. LC-7 was extracted with chloroform and n-butanol. The analysis through the Czech eight solvent systems revealed that the antibacterial substance was an alkaline water-soluble antibiotic. The antibacterial material was purified by exchange column, and precipitated with alcohol to obtain the crystal. The crystal was further purified by HPLC and analyzed by mass spectrometry. The results showed that the antimicrobial active substance was a new aminoglycoside antibiotic with a molecular weight of 365.1. In the field experiment,sp. LC-7 had significant control effect on tobacco bacterial wilt. The control efficacy was 85.48%.

actinomycetes;; aminoglycoside antibiotics; isolation and purification

S435.72

1007-5119（2017）02-0069-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2017.02.012

中國煙草總公司科技重點項目“基于宏基因組學的植煙土壤健康評價研究與應用”（110201402016）

羅文建（1991-），男，碩士，研究方向為微生物農藥。E-mail：746794072@qq.com。

，E-mail：xiangbikun@126.com

2016-10-22

2017-03-17