栝樓種子萌發期總黃酮含量變化研究

霍立群，張文霞，辛杰，張永清，李佳，劉紅燕

(山東中醫藥大學，山東 濟南 250355)

【中藥與天然活性產物】

栝樓種子萌發期總黃酮含量變化研究

霍立群，張文霞，辛杰，張永清，李佳*，劉紅燕

(山東中醫藥大學，山東 濟南 250355)

采用超聲輔助提取的方法，研究栝樓種子吸脹前期、吸脹期、萌動期、胚根伸長期、萌芽期及幼苗期6個時期的總黃酮含量及變化規律。各萌發階段的栝樓種子經石油醚脫脂后，以體積分數70%乙醇溶液為溶劑，采用超聲輔助提取法提取總黃酮，以蘆丁為標準品，采用比色法測定各萌發階段栝樓種子總黃酮含量。結果表明，栝樓種子中總黃酮含量較低，約為1 mg/g，整個萌發階段總黃酮含量呈現先下降后上升的趨勢，至幼苗期總黃酮含量已達2.7 mg/g。本研究為進一步認識及開發利用栝樓種子提供了參考，為人工調控栝樓種子中總黃酮含量提供了理論依據。

栝樓種子；萌發過程；總黃酮

瓜蔞子為葫蘆科植物栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim.)或雙邊栝樓(TrichosanthesrosthorniiHarms)的干燥成熟種子，具有潤肺化痰、滑腸通便的功效，主要用于治療燥咳痰黏、腸燥便秘[1]。瓜蔞子中富含油脂、甾醇、三萜及其苷、蛋白質、多種氨基酸、維生素，以及鈣、鐵、鋅、硒等16種無機元素[2]。目前關于瓜蔞子油脂、皂苷、氨基酸等成分研究的較多，而對黃酮的研究報道較少。

黃酮類化合物廣泛存在于自然界植物體內，屬于植物次生代謝產物。對植物而言，黃酮類化合物具有多種生物學功能，如調節植物生長、保護植物免受紫外線的損傷以及作為植物抗毒素(phytoalexin)和活性氧清除劑等，對入侵的病原物有直接的毒殺作用；其作為植物花和果實的色素，既是引誘劑，又是驅避劑，是植物體內重要的防御性次生代謝產物[3-4]。對于人類而言，黃酮類化合物大多與糖類結合為苷存在，可清除自由基，具抗氧化、抑菌、抗病毒、抗癌和抗腫瘤作用，對防治心血管疾病、肝病均有一定的療效。而且，黃酮類化合物對畜禽生產也有良好的促進功能[5]。本文對栝樓干種子及種子萌發期間黃酮含量的變化情況進行研究，以期為進一步了解栝樓種子生長及人工調控栝樓黃酮含量提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LHR-250-GS型人工氣候箱(廣東省醫療器械廠)；SW-CJ-1G型單人凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；HH-1型電熱恒溫水浴鍋(常州博遠實驗分析儀器廠)；LE204E/02型萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；GFL-230型電熱鼓風干燥箱(天津市萊博特瑞儀器有限公司)；KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)型循環水多用真空泵(鞏義市英峪高科儀器廠)；UV 5100B型紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)。

1.2 試劑

蘆丁標準品(上海源葉生物科技有限公司，質量分數大于98%)；濃硫酸(質量分數大于98%)；體積分數70%乙醇溶液(AR)；石油醚(沸程60～90 ℃)；質量分數10%硝酸鋁溶液(AR)；質量分數5%亞硝酸鈉溶液(AR)；質量分數4%氫氧化鈉溶液(AR)；實驗用水為蒸餾水。

1.3 材料

栝樓果實于2015年11月采收自山東中醫藥大學藥圃，采摘后懸掛在室內通風處，至果實晾干，取出種子，放在陰涼干燥處備用。經張永清教授鑒定，為葫蘆科栝樓屬植物栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim.)的干燥成熟種子。

2 方法與結果

2.1 發芽實驗方法

2.1.1 種子培養

參考許桂芳等[6-7]的方法對栝樓種子進行培養。選取籽粒飽滿、大小相近的栝樓種子1 000粒，濃硫酸浸泡10 min，蒸餾水洗去種子表面因酸蝕而形成的附著物后，在40 ℃溫水浸泡6 h，再轉冷水中浸泡24 h，取出用濾紙吸干表層水分，均勻放入鋪有3層濾紙的培養皿中，每皿30粒，放入30 ℃培養箱中進行萌發培養。及時補充培養皿中水分以保持培養條件濕潤；不正常種子、死種子及嚴重霉爛的種子需隨時揀出。

2.1.2 記錄

從種子培養的當天開始觀察，以種子吸水完全為吸脹期，以胚根突破種皮1～3 mm視為萌動期，胚根伸長至胚芽伸出前為伸長期，長出第一片真葉前為萌芽期，長至兩葉一心時為幼苗期，記錄種子生長至每個時期的日期。將第一粒種子胚根突破種皮之日作為萌發的開始，以后每天定時記錄萌發種子數，當連續幾天不再有種子萌發時作為萌發結束期。不正常種子、死種子及嚴重霉爛的種子及時揀出并記錄。計算發芽勢、發芽率。

具體指標計算方法如下:

發芽勢 = ( 萌發高峰期種子發芽數/供試種子數)× 100% ，

(1)

發芽率 = ( 種子發芽數/供試種子數)× 100% 。

(2)

2.1.3 實驗結果

種子培養第0天為吸脹前期，前3天無萌發現象，為吸水階段；第3天為吸脹期；自第4天開始出現萌發的種子，進入萌動期；第9～11天為胚根伸長期；第12～14天為萌芽期；第16～18天為幼苗期。所有培養的種子在第7天達萌發高峰期，整個發芽現象持續23 天，23 天以后沒有新的種子萌發。最終計算得發芽勢為85%，發芽率為93%。

2.2 總黃酮測定

2.2.1 樣品前處理

分別取6個萌發階段的栝樓種子于60 ℃烘箱中烘干，研缽研碎后濾紙包好，用石油醚回流2.0 h，除去色素和脂溶性成分，60 ℃烘干備用。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的蘆丁標準品9.8 mg于50 mL容量瓶中，用70%乙醇溶液溶解并定容至刻度，得0.196 mg/mL的蘆丁標準品溶液。

2.2.3 標準曲線繪制

精密吸取標準品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min；加10% 硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，再靜置6 min；加4% 氫氧化鈉4 mL，再加入70%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置15 min后，在510 nm處測其吸光度[8]。以吸光度為縱坐標，標準品質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，得標準曲線為：y= 11.184x- 0.012 67，R2= 0.999 53。x為標準品質量濃度(mg/mL)，y為吸光度值，結果如圖1所示。

圖1 標準曲線Fig.1 Standard curve

2.2.4 供試品溶液制備

分別稱取各時期樣品1.000 g置于100 mL具塞錐形瓶中，按液料比1∶40加入40 mL 70%乙醇溶液，70 ℃超聲提取1 h，提取1次，提取液冷卻并過濾于50 mL的容量瓶內，用70%乙醇溶液定容至刻度，即得供試品溶液，備用。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度實驗

精密吸取吸脹前的供試品溶液5 mL，置于10 mL容量瓶中，按照2.2.3 項下方法操作，于510 nm處測定吸光度，連續測定6次，計算相對標準偏差為0.67%，精密度良好，結果見表1。

表1 精密度實驗結果

2.3.2 重復性實驗

精密稱取吸脹前樣品1 g，按照2.2.4項下方法制備供試品溶液，按照2.2.3項下方法操作，于510 nm處測定吸光度，平行操作6次，計算相對標準偏差為1.57%。表明樣品測定符合技術要求，重現性良好，結果見表2。

表2 重復性實驗結果

2.3.3 穩定性實驗

精密吸取吸脹前的供試品溶液5 mL，按照2.2.3項下方法于510 nm處測定在反應5 、10、15、20、30 min時的吸光度，計算相對標準偏差為1.65%。表明 30 min 內樣品穩定性良好，結果見表3。

表3 穩定性實驗結果

2.3.4 加樣回收率實驗

采用標準加入法，精密稱取已測知總黃酮含量的吸脹前的樣品1 g，精密加入蘆丁標準品約1 mg，按照2.2.4項下方法制備供試品溶液，按照2.2.3項下方法于510 nm處測定吸光度，平行操作6份，計算平均回收率為99.07%，相對標準偏差為0.89%，結果見表4。

表4 加樣回收實驗結果

2.4 樣品測定

分別精密吸取各時期供試品溶液5 mL，按照2.2.3項下方法，于510 nm處測定吸光度值，重復6次，代入回歸方程計算出各時期供試品溶液稀釋后的總黃酮濃度，并計算各萌發階段種子中總黃酮含量，表5為各時期總黃酮濃度及含量結果，圖2為總黃酮含量變化趨勢。

表5 栝樓種子萌發期間總黃酮含量測定結果(n=6)

圖2 栝樓種子萌發過程中總黃酮含量變化趨勢Fig.2 Trend of the change of total flavonoids content during germination process of Trichosanthes kirilowii Maxim. seeds

由測定結果可以看出，栝樓種子中總黃酮含量較低，在1 mg/g上下波動。從圖2變化趨勢可看出，干種子中總黃酮含量大于吸脹期的種子，種子吸水進入萌動階段后，總黃酮含量隨種子繼續生長而逐漸增加，進入幼苗期時總黃酮含量增長迅速，總體呈現先下降后上升的趨勢。

3 分析與討論

研究表明[6-7,9-10]，栝樓種子存在休眠現象，萌發困難，出苗率低且不齊。針對栝樓破休眠及促萌的研究也有很多，本實驗采用文獻[6-7]的處理方法，雖然發芽勢為85%，發芽率達到93%，但同批處理的種子培養20 d以后仍有剛萌發者，即發芽不齊現象依然存在，尚待解決。

許多文獻表明[11-13]，成熟干種子自吸水至胚根突破種皮之前的階段，種子內部開始進行復雜的生理變化：干燥種子的鮮重急劇增加，一些酶也因為得到自由水而恢復代謝，細胞代謝空前旺盛，此時氧氣大量進入，呼吸速率顯著加快，此階段種子內多數物質開始被分解，含量降低；然而胚根突破種皮繼續生長至幼苗期的階段，種子會重吸收外界中的小分子代謝物，供細胞分裂和營養物質合成，從而使一部分成分積累增加。本實驗中栝樓種子萌發階段黃酮含量變化趨勢亦符合此變化規律：干種子(1.114 7 mg/g)到種子萌動前期(0.906 3 mg/g)總黃酮含量有所降低;胚根突破種皮后至萌芽期，總黃酮含量緩慢上升;至幼苗期，總黃酮含量迅速積累達2.715 3 mg/g。

總黃酮的合成還受多方面影響，基因表達[3]、酶活性變化(PAL酶)[14]、內源激素水平變化[15]及外界環境(光照、溫度等)[14]等均有可能影響總黃酮含量。植物內源激素中的生長素、乙烯和脫落酸有助于植物中黃酮類成分的合成與積累，而赤霉素則不利于黃酮類成分的合成，茉莉酸、茉莉酸甲酯和水楊酸也被證明可以誘導植物黃酮類成分的合成和積累[15]。礦質營養可以通過調控植物的碳、氮代謝過程以及植物體內內源激素代謝和關鍵酶活性等方面，從而影響黃酮類成分的合成代謝過程[14-15]。

4 結論

若想調控種子及植株生長，必須首先了解植株生長過程中內部成分的變化。本實驗對種子萌發過程中總黃酮積累規律進行研究，以期為調控植株生長提供參考。研究表明，栝樓種子萌發過程中總黃酮含量呈現先下降后上升的變化趨勢，基因表達、酶活性變化、內源激素水平等也是影響種子萌發的因素，可從這幾方面進行全面、系統地研究，找出栝樓種子萌發過程中影響總黃酮含量變化的關鍵點和關鍵物質，從而采取措施對黃酮類物質的合成及積累進行人工調控，如施以合理的礦質營養供應，促使其關鍵酶表達、活性和內源激素的變化朝著生產需要的方向發展等，進而更好地實現對栝樓的認識、開發和利用。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版一部[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010:82-84.

[2] 林樹花,李高陽,韓曉磊.栝樓籽的化學成分研究進展[J].農產品加工(創新版),2012(8): 73-76.

[3]康亞蘭,裴瑾,蔡文龍,等.藥用植物黃酮類化合物代謝合成途徑及相關功能基因的研究進展[J].中草藥,2014,45(9):1336-1341.

[4] TANAKA Y,SASAKI N,OHMIYA A.Biosynthesis of plant pigments:Anthocyanins, betalains and carotenoids[J].Plant Journal,2008,54(4):733-749.

[5]文開新,王成章,嚴學兵,等.黃酮類化合物生物學活性研究進展[J].草業科學,2010, 27 (6):115-122.

[6] 許桂芳,王鴻升,孟麗.瓜蔞種子休眠原因與破除休眠研究[J].氨基酸和生物資源,2010, 32(1): 28-30.

[7] 徐禮英,張小平.不同處理對栝樓種子萌發的影響[J].蕪湖職業技術學院學報,2008,10(4):74-77.

[8] 劉金娜,溫春秀,楊太新,等.瓜蔞子黃酮提取方法和參數優化的研究[J].時珍國醫國藥,2013,24(9):2088-2090.

[9] 孫婷,劉鵬,徐根娣.栝樓種子休眠特性分析[J].中國農業科學,2008,41(12):4273-4280.

[10] 孫婷.栝樓(TrichosantheskirilowliiMaxim.)種子的休眠特性及促萌措施研究[D].金華:浙江師范大學,2010.

[11] NONOGAKI H, BASSEL G W, BEWLEY J D.Germination-still a mystery[J]. Plant Sci,2010,179(6):574-581.

[12] BEWLEY J D, BLACK M. Seeds:Physiology of development and germination[M]. New York: Plenum Press, 1994.

[13] 吳香玉.綠豆萌發的動態代謝組學研究[D].武漢：中國科學院研究生院(武漢物理與數學研究所),2014.

[14]劉金福,李曉雁,孟蕊.苦蕎發芽過程中促進黃酮合成的因素初探[J].食品工業科技,2006, 27(10):106-108.

[15]劉大會,郭蘭萍,黃璐琦, 等.礦質營養對藥用植物黃酮類成分合成的影響[J].中國中藥雜志,2010,35(18):2367-2371.

Research on the change of total flavonoids content ofTrichosantheskirilowiiseeds during germination period

HUO Li-qun,ZHANG Wen-xia,XIN Jie，ZHANG Yong-qing,LI Jia*,LIU Hong-yan

(Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)

∶With the method of ultrasonic-assisted extraction, the content and its change rule of total flavonoids inTrichosantheskirilowiiseeds during six stages of prophase imbibition, imbibition, germination, radicle elongation, bud breaking and seedling were studied. After degreased by petroleum ether, total flavonoids ofTrichosantheskirilowiiseeds at different germination stage were extracted with 70% ethanol as solvent by ultrasonic-assisted extraction, and determined using rutin as the standard by colorimetry method. The results showed that total flavonoids content in the seeds ofTrichosantheskirilowiiwas low, about 1 mg/g, and it showed tendency to descend firstly and then ascend during the whole germination process, rising to 2.7 mg/g at seeding stage. This study provides references for further understanding and utilization ofTrichosantheskirilowiiseeds, and provides theoretical basis for artificial regulation of total flavonoids content inTrichosantheskirilowiiseeds.

∶Trichosantheskirilowiiseeds；germination process；total flavonoids

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.02.001

2016-08-08

國家中醫藥行業科研專項(201407002)；山東省高校科研發展計劃(J14LM06)

霍立群(1991—)，女，碩士研究生，研究方向為中藥質量與資源。

*通信作者，李佳。E-mail：ljytl7172@163.com

R284.1

A

1002-4026(2017)02-0001-06