紫葉白樺組培苗葉片花青素含量影響因素分析

楊玲，劉虹男，張冬嚴(yán)，沈海龍

(東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱，150040)

紫葉白樺組培苗葉片花青素含量影響因素分析

楊玲，劉虹男，張冬嚴(yán)，沈海龍*

(東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱，150040)

以紫葉白樺為試材，測(cè)定離體快繁過(guò)程中組培苗葉片花青素含量及其與葉綠素、類黃酮、類胡蘿卜素和總酚等物質(zhì)含量的比例關(guān)系，分析環(huán)境因素對(duì)組培苗葉片顏色和花青素含量的影響。結(jié)果表明：增殖階段的WPM培養(yǎng)基有利于花青素的合成。隨著培養(yǎng)基中激素濃度增加，花青素合成被抑制，這種抑制作用沒(méi)有激素種類差異。培養(yǎng)基中缺乏蔗糖會(huì)減少花青素積累。較低pH值和溫度以及延長(zhǎng)光照時(shí)間對(duì)花青素積累有促進(jìn)作用。強(qiáng)光照可增加組培微枝和再生植株葉片中花青素含量，但降低了葉綠素的含量和比例。隨著花青素比例減小，類黃酮和總酚含量減小，葉綠素比例增加，類胡蘿卜素比例增加。研究結(jié)果為培育紫葉白樺優(yōu)質(zhì)觀賞苗木提供了理論指導(dǎo)和參考依據(jù)。

紫葉白樺；離體快繁；花青素；葉綠素

0 引言

紫葉白樺(Betulapopulifolia‘Whitespire’×B.‘Crimson Frost’)是歐洲白樺和亞洲白樺經(jīng)過(guò)反復(fù)雜交并根據(jù)葉色特征長(zhǎng)期選育出來(lái)的新品種，是適合一年四季觀賞的優(yōu)良樹(shù)種。紫葉白樺具有抗蟲(chóng)性強(qiáng)，喜光照，耐潮濕，適應(yīng)性廣，易種植的特點(diǎn)。由于紫葉白樺常表現(xiàn)為花無(wú)育性、不產(chǎn)生種子或產(chǎn)生的種子不能形成具有穩(wěn)定遺傳性狀的小植株，所以一直以嫩枝扦插或嫁接的方式進(jìn)行繁殖。國(guó)外對(duì)紫葉白樺的繁殖研究較早，已經(jīng)建立了通過(guò)組織培養(yǎng)手段的紫葉白樺離體快繁技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)紫葉白樺的快速、高效繁殖及大規(guī)模推廣種植(個(gè)人通訊)。國(guó)內(nèi)關(guān)于紫葉白樺的研究起步較晚，但目前已經(jīng)建立了通過(guò)組織培養(yǎng)手段的紫葉白樺離體快繁技術(shù)方法[1]，并對(duì)紫葉白樺扦插和嫁接技術(shù)進(jìn)行了初步研究[2]。與扦插和嫁接方法相比較，通過(guò)組織培養(yǎng)手段的離體快繁方法是目前國(guó)內(nèi)比較成熟的紫葉白樺繁殖技術(shù)，具有繁殖系數(shù)大、繁殖速度快、苗木性狀穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。但在紫葉白樺離體快繁過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)紫葉白樺組培苗葉片顏色的穩(wěn)定性較差，葉色受環(huán)境條件的影響容易發(fā)生明顯的改變。已知彩葉植物的葉色形成是由遺傳因素和外部環(huán)境共同作用的結(jié)果，通過(guò)改變植物葉片中色素的種類、含量及分布形成了多彩的葉色[3]。利用環(huán)境因子調(diào)控花青素等色素物質(zhì)含量將會(huì)極大地提高植物的觀賞價(jià)值[3]。本研究以紫葉白樺離體快繁過(guò)程中的試管苗和再生植株為研究對(duì)象，測(cè)定了試管苗和再生植株葉片花青素含量以及葉綠素含量、類黃酮含量、類胡蘿卜素含量和總酚含量的變化，分析了6種環(huán)境因素對(duì)花青素等物質(zhì)含量及其比例的影響。研究結(jié)果為了解紫葉白樺組培苗葉色變化影響因素奠定基礎(chǔ)，為培育紫葉白樺優(yōu)質(zhì)觀賞苗木提供理論指導(dǎo)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

研究材料來(lái)自美國(guó)威斯康星州Evergreen苗圃獲得的試管內(nèi)紫葉白樺無(wú)菌莖芽。將試管內(nèi)無(wú)菌莖芽的葉片去除，將莖剪切成2.0 cm長(zhǎng)度、帶頂芽或腋芽的莖段作為外植體，平行或垂直接種到培養(yǎng)基上。每個(gè)培養(yǎng)瓶(500 mL容量)內(nèi)裝50 mL培養(yǎng)基，每培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)接種10個(gè)莖段。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 莖芽增殖培養(yǎng)方法

分別采用MS、1/2MS和WPM作為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中分別含有不同濃度的6-BA(0.0、0.2、0.4、0.8 μM)和NAA(0、0.05、0.1 μM)組合。各培養(yǎng)基中分別添加15、20、25、30 g/L蔗糖，培養(yǎng)基的pH值在121℃高壓滅菌20 min前分別調(diào)節(jié)為5.0、5.4、5.8、6.2、6.6。所有培養(yǎng)基內(nèi)均添加6.0 g/L瓊脂作為固化劑。每種培養(yǎng)基重復(fù)10瓶。培養(yǎng)條件：30℃下每天光照16 h或20 h，光照強(qiáng)度75 μmol/(m2·s)。接種后培養(yǎng)30 d時(shí)測(cè)定葉片花青素等物質(zhì)含量。

1.2.2 莖芽增壯培養(yǎng)方法

將增殖獲得的莖芽單獨(dú)剪切下來(lái)，垂直接種到增壯培養(yǎng)基上。每培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)接種10個(gè)莖芽。采用WPM作為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加20 g/L蔗糖，培養(yǎng)基的pH值在121℃高壓滅菌20 min前調(diào)節(jié)為6.2。培養(yǎng)基內(nèi)添加6.0 g/L瓊脂作為固化劑。重復(fù)10瓶。光周期條件實(shí)驗(yàn)：25℃下每天光照20 h，光照強(qiáng)度分別為55、65、75和85 μmol/(m2·s)。接種后培養(yǎng)30 d時(shí)測(cè)定葉片花青素等物質(zhì)含量。

1.2.3 莖芽生根培養(yǎng)方法

將經(jīng)過(guò)增壯培養(yǎng)的莖芽(微枝)進(jìn)行試管外生根培養(yǎng)。在生根基質(zhì)(草炭土、蛭石和珍珠巖以5∶2∶3體積比混合)中培養(yǎng)30 d，培養(yǎng)條件為30℃下每天光照20 h，光照強(qiáng)度75 μmol/(m2·s)。然后分別轉(zhuǎn)移到光照強(qiáng)度為28 μmol/(m2·s)和110 μmol/(m2·s)的條件下培養(yǎng)30 d。取各處理的再生植株頂部第1～3片葉進(jìn)行測(cè)量花青素等物質(zhì)含量。

1.2.4 花青素等物質(zhì)含量的測(cè)定

花青素含量測(cè)定參考王慶菊等(2008)的方法[4]：稱取0.2 g葉片，將葉片剪切成0.2 cm×0.2 cm大小的方塊，用1.5 mmol/L HCl / 95%乙醇=15/85(v/v)的混合溶液在黑暗中浸提24 h以提取葉片中的花青素，然后在OD535 nm下檢測(cè)吸光值。花青素含量以單位體積單位質(zhì)量下的吸光值(U/(g·mL))表示；類黃酮含量和總酚含量的測(cè)定：提取方法同花青素提取方法一樣，分別在OD325 nm和OD280 nm下檢測(cè)吸光值[5]，以單位體積單位質(zhì)量下的吸光值(U/(g·mL))表示類黃酮含量或總酚含量；葉綠素含量和類胡蘿卜素含量采用丙酮法測(cè)定[5]。全部測(cè)定均重復(fù)3次。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

表格和圖中數(shù)據(jù)均為各處理的“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”。采用的數(shù)據(jù)用于方差分析，平均數(shù)在P=0.05或P=0.01水平上進(jìn)行了鄧肯多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖芽增殖階段的花

2.1.1 培養(yǎng)基種類對(duì)花青素等含量的影響

培養(yǎng)基種類對(duì)葉片花青素含量的影響及多重比較如圖1所示。方差分析結(jié)果表明，各種培養(yǎng)基對(duì)花青素含量的影響差異極顯著(P<0.01)。各種培養(yǎng)基中，WPM培養(yǎng)基的花青素含量最高，達(dá)到1.28 U/(g·mL)，與MS、1/2MS培養(yǎng)基差異極顯著(P<0.01)。MS與1/2 MS的差異也達(dá)到了顯著水平(P<0.05)，其花青素含量分別為0.27 U/(g·mL)(MS)和0.24 U/(g·mL)(1/2MS)。因此，相對(duì)于MS和1/2MS，WPM培養(yǎng)基有利于紫葉白樺莖芽增殖培養(yǎng)中葉片花青素的合成。

不同培養(yǎng)基上，葉片中花青素與葉綠素、類黃酮、類胡蘿卜素和總酚等物質(zhì)含量的比例關(guān)系如圖2所示。3種培養(yǎng)基中，WPM上的花青素比例最高(5.70%)，葉片表現(xiàn)為紫紅色；其次是MS(1.45%)，葉片為深綠色，邊緣紫紅色；最后是1/2MS(1.06%)，葉片為深綠色。隨著花青素比例增加，葉片中葉綠素(葉綠素a和b)的比例減小，類黃酮比例增加，類胡蘿卜素比例減小，總酚含量變化不明顯。

圖1 培養(yǎng)基種類對(duì)葉片花青素含量影響Fig.1 Effects of culture medium types on content of anthocyaninin Royal Frost Betula leaves

圖2 不同培養(yǎng)基上紫葉白樺葉片顏色變化和色素組成的影響Fig.2 Effects of different culture mediums on color change and pigment composition of Royal Frost Betula leavesA：葉片深綠色 B：葉片邊緣紫紅色 C：葉片紫紅色

2.1.2 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)花青素等含量的影響

培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)葉片花青素含量的影響及多重比較如圖3所示。方差分析結(jié)果表明，各種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)花青素含量的影響差異極顯著(P﹤0.01)。各種組合中，無(wú)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的處理中花青素含量最高，達(dá)到2.45 U/(g·mL)，與其他處理差異極顯著(P﹤0.01)。隨后是只添加0.2 μM BA、0.05 μM NAA、0.1 μM NAA的處理的花青素含量分別居于第2位、第3位和第4位。當(dāng)培養(yǎng)基中NAA濃度一定時(shí)，隨著B(niǎo)A濃度的增加，花青素含量下降；當(dāng)培養(yǎng)基中BA濃度一定時(shí)，隨著NAA濃度的增加，花青素含量下降；花青素含量最低的處理是0.1 μM NAA+0.8 μM BA(0.96 U/(g·mL))。說(shuō)明增殖培養(yǎng)中培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑不利于莖芽花青素的合成，隨著生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度的增加，對(duì)花青素合成的抑制作用增強(qiáng)，并且這種抑制作用沒(méi)有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類的差異。

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理對(duì)葉片中花青素與葉綠素、類黃酮、類胡蘿卜素和總酚等物質(zhì)含量比例關(guān)系的影響(圖4)。如圖3和4所示，無(wú)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理的葉片花青素含量雖然最高，其花青素比例占3.57%，但葉片表現(xiàn)為深綠色(邊緣紫紅色)；0.1 μM NAA+0.8 μM BA處理的葉片花青素含量雖然最低，但其花青素比例占5.57%，葉片表現(xiàn)為紫紅色。隨著葉片中花青素比例增加，類黃酮比例增加，總酚比例略有增加，葉綠素(葉綠素a和b)比例減小，類胡蘿卜素比例略有減小。說(shuō)明影響葉片顏色變化的不是葉片中花青素的含量，而是其與葉綠素等色素含量的比例。

圖3 不同PGR組合對(duì)葉片花青素含量的影響Fig.3 Effects of different combinations of plant growth regulatorson the contents of anthocyanin in Royal Frost Betula leaves

圖4 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)紫葉白樺葉片顏色變化和色素組成的影響Fig.4 Effects of different combinations of plant growth regulators on color change and pigment composition of Royal Frost Betula leaves

2.1.3 蔗糖濃度對(duì)花青素等含量的影響

蔗糖濃度對(duì)葉片花青素含量的影響及多重比較結(jié)果如圖5所示。方差分析結(jié)果表明，各種蔗糖濃度對(duì)花青素含量的影響差異極顯著(P﹤0.01)。各種蔗糖濃度中，20 g/L蔗糖處理的花青素含量最高，達(dá)到1.28 U/(g·mL)，與其他處理相比差異極顯著(P﹤0.01)。其他濃度的花青素含量分別為1.09 U/(g·mL)(15 g/L)、0.64 U/(g·mL)(25 g/L)、0.34 U/(g·mL)(30 g/L)。因此，培養(yǎng)基中添加20 g/L蔗糖有利于增殖培養(yǎng)中葉片花青素的合成。其次是15、25 g/L，最低的是30 g/L蔗糖的處理。即較低濃度的蔗糖有利于花青素合成和積累。

不同蔗糖濃度對(duì)葉片中花青素與葉綠素、類黃酮、類胡蘿卜素和總酚等物質(zhì)含量比例關(guān)系的影響如圖6所示。不同濃度蔗糖處理中，20 g/L蔗糖處理的花青素比例最高(5.65%，葉片紫紅色)，15和25 g/L的處理居中(5.54%和 5.58%，葉片紫紅色)，最低的是30 g/L蔗糖處理(1.47%，葉片深綠色)。當(dāng)蔗糖濃度大于20 g/L時(shí)，隨著蔗糖濃度增加，花青素比例減小，類黃酮比例減小，總酚比例減小，類胡蘿卜素和葉綠素(a和b)比例增加。

圖5 蔗糖濃度對(duì)葉片中花青素含量的影響Fig.5 Effects of sucrose concentration on content of anthocyanin in l Royal Frost Betula leaves

圖6 蔗糖濃度對(duì)紫葉白樺葉片色素組成的影響Fig.6 Effects of sucrose concentrations on color change and pigment composition of Royal Frost Betula leaves

2.1.4 培養(yǎng)基酸堿度對(duì)花青素等含量的影響

培養(yǎng)基酸堿度對(duì)葉片花青素含量的影響和多重比較結(jié)果如圖7所示。方差分析結(jié)果表明，不同處理中，除pH5.0對(duì)花青素含量的影響差異顯著(P﹤0.05)外，其余酸堿度對(duì)花青素含量的影響差異極顯著(P﹤0.01)。各種處理中，pH6.2的處理中花青素含量最高，達(dá)到1.35 U/(g·mL)，與其他處理差異極顯著(P﹤0.01)。隨后是pH5.8、pH5.4和pH5.0處理的花青素含量分別居于第2、3和4位，最后是pH6.6處理的花青素含量最低。

不同培養(yǎng)基pH值對(duì)葉片中花青素與葉綠素、類黃酮、類胡蘿卜素和總酚等物質(zhì)含量比例關(guān)系的影響如圖8所示。不同培養(yǎng)基pH值處理中，pH5.4處理的花青素比例最高(8.35%，葉片紫紅色)，其次是pH6.2的處理(7.54%，葉片紫紅色)，然后是pH5.0(7.38%，葉片紫紅色)和pH5.8(5.65%，葉片紫紅色)，最低的是pH6.6處理(1.35%，葉片深綠色)。隨著花青素比例減小，葉綠素比例增加，類黃酮和總酚比例減小，類胡蘿卜素比例變化不大。說(shuō)明微酸性環(huán)境有利于莖芽增殖培養(yǎng)中葉片花青素的合成，堿度過(guò)大不利于花青素合成。

圖7 培養(yǎng)基酸堿度對(duì)葉片花青素含量的影響Fig.7 Effects of PH values on contents of anthocyanin in leaves of Royal Frost Betula

圖8 培養(yǎng)基pH值對(duì)紫葉白樺葉片色素組成的影響Fig.8 Effects of pH values on color change and pigment composition of Royal Frost Betula leaves

2.1.5 溫度和光周期對(duì)花青素等含量的影響

不同培養(yǎng)溫度和光周期組合對(duì)葉片花青素含量的影響和多重比較結(jié)果如圖9所示。方差分析結(jié)果表明，3種培養(yǎng)條件對(duì)花青素含量的影響差異極顯著(P﹤0.01)。各種組合中，25℃、光照20 h處理的花青素含量最高，達(dá)到1.28 U/(g·mL)，與其他處理差異極顯著(P﹤0.01)。相同溫度(30℃)下，光照16 h處理的花青素含量比光照20 h處理的含量高，而在相同光照時(shí)間(20 h)下，25℃比30℃處理的花青素含量高。

不同溫度和光周期對(duì)葉片中花青素與葉綠素、類黃酮、類胡蘿卜素和總酚等物質(zhì)含量比例關(guān)系的影響如圖10所示。不同處理中，25℃、光照20 h處理的花青素比例最高(5.65%，葉片紫紅色)，其次是30℃、光照20 h處理(3.47%，葉片紫紅色)，

然后是30℃、光照16 h處理(2.08%，葉片紫紅色)。隨著花青素比例減小，類黃酮和總酚含量減小，葉綠素比例增加，類胡蘿卜素比例增加。因此認(rèn)為降低培養(yǎng)溫度會(huì)促進(jìn)花青素的積累，延長(zhǎng)光照時(shí)間可以促進(jìn)葉片中花青素比例增加。

圖9 培養(yǎng)溫度和光周期對(duì)葉片花青素含量的影響Fig.9 Effects of culture temperature and photoperiod on the contents of anthocyanin in leaves of Royal Frost Betula

圖10 溫度和光周期對(duì)紫葉白樺葉片色素組成的影響Fig.10 Effects of temperature and photoperiod on color change and pigment composition of Royal Frost Betula leaves

2.2 莖芽增壯階段的花青素等物質(zhì)含量

光照強(qiáng)度對(duì)微枝葉片花青素含量的影響和多重比較結(jié)果如圖11所示。方差分析結(jié)果表明，4種光照條件對(duì)葉片中花青素含量的影響達(dá)到極顯著水平(P﹤0.01)。高強(qiáng)度的光照可以增加葉片中的花青素含量。各處理中，85 μmol/(m2·s)處理的微枝葉片中花青素含量最高(1.39 U/(g·mL))；其次是75 μmol/(m2·s)處理的(1.33 U/(g·mL))。

圖11 光照強(qiáng)度對(duì)微枝花青素含量的影響Fig.11 Effects of illumination intensity on content of anthocyanin in microscopes of Royal Frost Betula

不同光照強(qiáng)度對(duì)葉片中花青素與葉綠素、類黃酮、類胡蘿卜素和總酚等物質(zhì)含量比例關(guān)系的影響如圖12所示。不同處理中，75 μmol/m2·s處理的花青素比例最高(3.07%，葉片紫紅色)，其次是85 μmol/(m2·s)處理(2.99%，葉片紫紅色)，其余兩種光照強(qiáng)度下葉片為深綠色。光照強(qiáng)度在55 μmol/(m2·s)增加到75 μmol/(m2·s)的范圍內(nèi)，隨著花青素比例增加，葉綠素a比例增加。當(dāng)光照強(qiáng)度超過(guò)75 μmol/(m2·s)時(shí)，葉綠素a比例大幅減小，葉綠素b比例大幅增加。當(dāng)光照強(qiáng)度為75 μmol/(m2·s)時(shí)，雖然花青素比例最大，但微枝高度最小，地徑最細(xì)。這表明，較強(qiáng)的光照強(qiáng)度雖然可以提高葉片中花青素含量、增加微枝的觀賞性，但同時(shí)微枝的生長(zhǎng)速度減慢，生物量積累下降。

圖12 光照強(qiáng)度對(duì)紫葉白樺葉片色素組成的影響Fig.12 Effects of illumination intensity on color change and pigment composition of Royal Frost Betula leaves

2.3 光照強(qiáng)度對(duì)再生植株花青素等含量的影響

光照強(qiáng)度對(duì)生根后再生植株葉片中花青素含量的影響和多重比較結(jié)果如圖13所示。方差分析結(jié)果表明，2種光照條件對(duì)葉片中花青素含量的影響均達(dá)到極顯著水平(P﹤0.01)。2種處理中，110 μmol/(m2·s)處理的葉片花青素含量最高，達(dá)到1.65 U/(g·mL)，與28 μmol/(m2·s)處理的葉片花青素含量(0.39 U/(g·mL))差異極顯著(P﹤0.01)。

不同光照強(qiáng)度對(duì)葉片中花青素與葉綠素、類黃酮、類胡蘿卜素和總酚等物質(zhì)含量比例關(guān)系的影響如圖14所示。2種處理中，110 μmol/(m2·s)處理的葉片中花青素含量所占比例最高(4.54%，葉片紫紅色)，而28 μmol/(m2·s)處理的非常低(0.88%，葉片綠色)。低光照強(qiáng)度下，花青素比例減小，類黃酮和總酚含量減小，葉綠素比例增加，類胡蘿卜素比例增加。因此認(rèn)為強(qiáng)光照可以促進(jìn)花青素的積累，但降低了葉綠素的含量和比例，強(qiáng)光下紫葉白樺葉片可以保持紫紅色的特征，但由于葉綠素含量較少，使得植株光合作用減弱，植株高生長(zhǎng)受到抑制。反之，低光照強(qiáng)度雖然減少了花青素的合成，但葉綠素含量增加，因此植株光合作用較強(qiáng)，植株生長(zhǎng)較快，高生長(zhǎng)旺盛。

圖13 光照強(qiáng)度對(duì)再生植株葉片花青素含量的影響Fig.13 Effects of illumination intensity on contents of anthocyanin of regeneration plant leaves of Royal Frost Betula

圖14 光照強(qiáng)度對(duì)對(duì)紫葉白樺葉片再生植株色素組成的影響Fig.14 Effects of illumination intensity on color change and pigment composition in regeneration plant leaves of Royal Frost Betula

綜上所述，在紫葉白樺試管苗增殖培養(yǎng)過(guò)程中，低鹽濃度的WPM培養(yǎng)基有利于葉片花青素合成。培養(yǎng)基中添加激素不利于花青素合成，隨著激素濃度增加，抑制花青素合成作用增強(qiáng)，且這種抑制作用沒(méi)有激素種類的差異。培養(yǎng)基中缺乏蔗糖，會(huì)削減花青素積累，但當(dāng)蔗糖濃度高過(guò)臨界點(diǎn)時(shí)，蔗糖濃度會(huì)限制花青素積累。較低pH和溫度有利于花青素積累。延長(zhǎng)光照時(shí)間有利于花青素積累。在紫葉白樺試管苗的增壯培養(yǎng)過(guò)程中，較高強(qiáng)度光照可增加葉片中花青素含量。強(qiáng)光照可促進(jìn)生根后再生植株葉片中花青素積累，但降低了葉綠素含量和比例。因此，雖然強(qiáng)光下紫葉白樺葉片可以保持紫紅色的特征，但由于葉綠素含量較少，植株高生長(zhǎng)受到抑制。

3 討論

3.1 培養(yǎng)基種類對(duì)花青素含量影響

花青素主要在植物液泡中積累，是構(gòu)成植物花和果實(shí)顏色的主要色素之一[6]。培養(yǎng)基種類對(duì)于花青素的積累起著十分重要的作用[7]。本研究表明，與MS和1/2MS相比較，WPM培養(yǎng)基更有利于紫葉白樺莖芽增殖培養(yǎng)中葉片花青素的合成。在4種離子中，Cu2+和Zn2+對(duì)其穩(wěn)定性影響較大，Na+和Ca2+的影響較小[8]。所以，在不同種類培養(yǎng)基所含Cu2+和Zn2+相同的情況下，可能是微量元素對(duì)花青素的積累形成起到大的促進(jìn)作用，但仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)花青素含量影響

激素不僅直接影響細(xì)胞分裂的速度，還參與細(xì)胞內(nèi)的多種生理生化反應(yīng)，因此植物激素也是影響植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)花青素的重要因素[9]。植物細(xì)胞培養(yǎng)最常用的生長(zhǎng)素有：2，4-D、IAA、NAA等，不同的植物細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)素的種類與含量要求不同。大量研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的生長(zhǎng)素促進(jìn)花青素的合成，而高濃度則抑制其合成[10]。Zhou等[11]在煙草愈傷組織中研究發(fā)現(xiàn)，0.02 mg/L的2，4-D或NAA產(chǎn)生的花青素最多，而0.2 mg/L的2，4-D或2 mg/L的NAA則使花青素的含量降低一半，表明高濃度的2，4-D或NAA可以抑制花青素的合成。這與本研究結(jié)果相一致，培養(yǎng)基中不添加2，4-D和NAA產(chǎn)生的花青素含量最高，增殖培養(yǎng)基中添加任何種類生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑都抑制莖芽花青素的合成。另外有研究發(fā)現(xiàn)，植物激素調(diào)節(jié)花青素的生物合成是通過(guò)影響花青素合成過(guò)程中的酶活性來(lái)調(diào)節(jié)的[12]。通過(guò)外源2，4-D或NAA處理葡萄果實(shí)，抑制花青素生物合成所有結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)[13]。Ji等[14]通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)揭示了高濃度2，4-D或NAA抑制花青素合成結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。

3.3 蔗糖濃度對(duì)花青素含量影響

有機(jī)物中對(duì)花青素積累影響較大的是碳源[15]。蔗糖作為產(chǎn)生花青素最好的碳源之一，通過(guò)多途徑影響植物花青素的合成。首先，蔗糖作為能源物質(zhì)保證植物生長(zhǎng)和花青素的生物合成；其次，蔗糖是花青素的合成前體，參與花色素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的調(diào)控；第三，蔗糖作為轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的初級(jí)信使因子，參與植物生長(zhǎng)周期各個(gè)階段的活動(dòng)[16]。但若碳源含量過(guò)高，會(huì)使植物細(xì)胞出現(xiàn)過(guò)早死亡的現(xiàn)象，不利于花青素的產(chǎn)生和積累，故需要根據(jù)細(xì)胞的不同來(lái)選擇不同種類和濃度較為適宜的碳源[12]。喜樹(shù)(Camptotheca acuminata)細(xì)胞可以通過(guò)較高的蔗糖含量來(lái)促進(jìn)花青素的產(chǎn)生，當(dāng)蔗糖濃度為292 mmol/L時(shí)產(chǎn)生花青素含量最高[17]。擬南芥(Arabidopsis thaliana)的生長(zhǎng)發(fā)育和葉片著色需要蔗糖[18-19]。Moalem等[20]的研究表明，GA3對(duì)牽牛花冠(Petunia Corollas)細(xì)胞花青素積累及其相關(guān)基因表達(dá)的誘導(dǎo)依賴于糖。本研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基中缺乏蔗糖，會(huì)削減紫葉白樺花青素的積累，但當(dāng)蔗糖濃度高過(guò)某一臨界點(diǎn)時(shí)，蔗糖濃度會(huì)限制花青素的積累。

3.4 培養(yǎng)基酸堿度對(duì)花青素含量影響

花青素類色素也受pH值的影響[12]。在紫色大白菜[Brassica campestris L.ssp.pekinensis(Lour)Olsson]花青素穩(wěn)定性的研究中發(fā)現(xiàn)[21]，pH值對(duì)其穩(wěn)定性影響明顯，pH值為3時(shí)紫色大白菜花青素的保存率隨時(shí)間延長(zhǎng)基本保持不變；而pH值為5～7時(shí)，隨處理時(shí)間延長(zhǎng)有所降低，pH值為9時(shí)花青素的保存率卻隨著時(shí)間的延長(zhǎng)有先降低后升高現(xiàn)象。這與本研究結(jié)果相似，微酸性培養(yǎng)基更有利于莖芽增殖培養(yǎng)中葉片花青素的合成，堿度過(guò)大不利于花青素合成。

3.5 培養(yǎng)溫度對(duì)花青素含量影響

溫度對(duì)花青素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)起著至關(guān)重要的作用，低溫會(huì)誘導(dǎo)花青素苷合成相關(guān)基因的表達(dá)，如可使PAL、CHS、CHI和DFR基因的轉(zhuǎn)錄水平升高幾倍，會(huì)促進(jìn)花青素的合成；高溫抑制基因的表達(dá)，導(dǎo)致花青素合成減少和分解增加[22]。使花青素苷含量降低合適的溫度可促使植物細(xì)胞生長(zhǎng)，植物細(xì)胞最適生長(zhǎng)溫度一般在20～25℃[9]。對(duì)其他很多物種如玉米、擬南芥和矮牽牛等的研究中發(fā)現(xiàn)，低溫則已證實(shí)可以誘導(dǎo)多種植物幼苗花青素積累[23]。本研究結(jié)果得出，相同光照時(shí)間(20 h)下，25℃比30℃處理的花青素含量高，達(dá)到1.28 U/(g·mL)，說(shuō)明低溫度更有利于紫葉白樺花青素的積累。

3.6 光照對(duì)花青素含量的影響

在綠色組織(如葉片、花芽和莖等)以及組織培養(yǎng)的細(xì)胞中，光通過(guò)激活花青素苷代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)花青素苷的積累[3]。但光對(duì)花青素的影響是兩方面的，首先光是花青素生物合成的重要因子，與此同時(shí)光又會(huì)加速花青素的降解[24]。本研究中，光照強(qiáng)度對(duì)花青素含量的影響非常顯著。110 μmol/(m2·s)處理的葉片花青素含量最高，達(dá)到1.65 U/(g·mL)，是28 μmol/(m2·s)處理的4倍以上。這說(shuō)明，較高的光照強(qiáng)度有利于紫葉白樺幼苗葉片保持紫紅色特征，但由于花青素所占的比例較高，葉綠素合成受到抑制，所以表現(xiàn)為植株矮小，而低光照條件下，雖然花青素含量受到抑制，但葉綠素含量相對(duì)比較高，因此植株高生長(zhǎng)旺盛，這種植株相對(duì)強(qiáng)光照條件下培養(yǎng)的具有紫紅色葉片的植株生長(zhǎng)較快，高度增加很多。分析原因是強(qiáng)光下培養(yǎng)的植株由于葉綠素含量較少，使得植株光合作用減弱，植株高生長(zhǎng)受到抑制。而低光照強(qiáng)度雖然減少了花青素的合成，但葉綠素含量增加，因此植株光合作用較強(qiáng)，植株生長(zhǎng)較快，高生長(zhǎng)旺盛。這個(gè)研究結(jié)果提示我們，在紫葉白樺苗木培育過(guò)程中，為了加快苗木培育速度，可以先用較低強(qiáng)度的光照培養(yǎng)紫葉白樺苗木，獲得高生長(zhǎng)旺盛的苗木；當(dāng)苗木高度達(dá)到理想的要求時(shí)，適當(dāng)增加光照強(qiáng)度，促進(jìn)苗木葉片中花青素的合成，從而達(dá)到縮短苗木培育周期，獲得高質(zhì)量的觀賞性強(qiáng)的紫葉白樺苗木的目的。

3.7 色素比對(duì)葉片顏色的影響

高等植物葉片中的色素主要有三大類：一為葉綠素，其中包括葉綠素a和葉綠素b；二為類胡蘿卜素，主要包括類胡蘿卜和葉黃素；三為類黃酮，包括黃酮類 、黃酮醇類、黃烷酮類、花色素苷等。不同的色素在外觀上表現(xiàn)出不同的顏色，葉綠素a表現(xiàn)為藍(lán)綠色，葉綠素表現(xiàn)b為黃綠色，類胡蘿卜素表現(xiàn)為橙黃色，葉黃素表現(xiàn)為黃色，類黃酮的顏色取決于B環(huán)上的代甲基團(tuán)，當(dāng)甲基取代時(shí)產(chǎn)生變紅的效應(yīng)，花色素苷與黃酮醇或貢酮結(jié)合，產(chǎn)生藍(lán)色效應(yīng)[25]。彩葉植物呈現(xiàn)彩色的直接原因是葉片中的色素種類和比例發(fā)生了變化[26]。其中花色素苷和類胡蘿卜素含量變化是植物呈現(xiàn)彩色的根本因素，其含量變化受遺傳因素和外界各種因素的影響[27]。本研究中發(fā)現(xiàn)，影響葉片顏色變化的不是葉片中花青素的含量，而與葉綠素等色素含量的比例有關(guān)。

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Analysis of Factors Influencing on Anthocyanin Content in Leaves of Tissue Culture Plantlet of Royal FrostBetula

Yang Ling，Liu Hongnan，Zhang Dongyan，Shen Hailong*

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding，Northeast Forestry University Harbin 150040)

The Content of anthocyanin of plantlets leaves and the proportion of anthocyanin，chlorophyll，flavonoid，carotenoid and total phenol was measured in vitro rapid propagation by taking royal FrostBetulaas the experimental material.The effects of environmental factors on the color change of leaves and the content of anthocyanins were analyzed.The results showed that WPM proliferation medium was useful to the accumulation of anthocyanins.The synthesis of anthocyanin was inhibited with the increase of hormone concentration.There were no differences in hormone types during the inhibitory effect.Lacking sucrose in the medium reduced the accumulation of anthocyanins.The lower PH value and temperature had positive effects on the accumulation of anthocyanins.Prolonged illumination time can facilitate the accumulation of anthocyanins as well.Strong illumination can improve the contents of anthocyanin in microscopes of tissue culture and leaves of regeneration plant while the content and proportion of chlorophyll decreased.Contents of flavonoid and total phenol decreased with the anthocyanin decreasing.The proportion of chlorophyll and carotenoid increased with the decrease of anthocyanin.The results of this research provided the theory guidance and reference for cultivating quality ornamental nursery stock of Royal FrostBetula.

Royal FrostBetula；in vitro rapid propagation；anthocyanin；chlorophyll

2016-09-14

黑龍江省博士后科研啟動(dòng)金資助項(xiàng)目(LBH-Q14003)

楊玲，博士，副教授。研究方向：樹(shù)木微繁和林木種苗培育原理與技術(shù)。

*通信作者：沈海龍，博士，教授。研究方向：林木種苗培育原理與技術(shù)。E-mail：shenhl-cf@nefu.edu.cn

楊玲，劉虹男，張冬嚴(yán)，等.紫葉白樺組培苗葉片花青素含量影響因素分析[J].森林工程，2017，33(2)：33-40.

S 687

A

1001-005X(2017)02-0033-08