干旱脅迫對柴胡中柴胡皂苷合成途徑關鍵酶活性及柴胡皂苷含量的影響

韓曉偉 馮紅 馮建明 嚴玉平 張丹 鄭開顏 鄭玉光

摘要：目的 研究干旱脅迫對柴胡中柴胡皂苷合成途徑關鍵酶活性及皂苷含量的影響，從蛋白水平揭示柴胡對干旱脅迫的響應。方法 通過盆栽控水試驗，設置土壤飽和含水量的70%～80%、60%～70%、40%～50%、20%～30%共4個水平栽培柴胡。采用酶聯免疫法檢測6個月和1年生柴胡根中4種柴胡皂苷合成途徑關鍵酶3-羥基-3-甲基-戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGR）、異戊烯基焦磷酸異構酶（IPPI）、法尼基焦磷酸合酶（FPS）和β-香樹素合成酶（β-AS）的活性，采用HPLC檢測不同土壤飽和含水量情況下樣品中柴胡皂苷a、d的含量。結果 柴胡苗在飽和含水量40%～50%時4種酶的活性最高，在飽和含水量60%～70%、70%～80%時次之，在飽和含水量20%～30%時最低，柴胡皂苷a、d含量變化與酶活性變化趨勢相似。結論 40%～50%土壤飽和含水量能顯著提高柴胡皂苷合成途徑關鍵酶活性，且柴胡皂苷含量與酶活性之間呈顯著正相關，說明在干旱脅迫下，柴胡通過調節柴胡皂苷合成途徑關鍵酶活性來調節柴胡皂苷的合成，對干旱脅迫作出響應。

關鍵詞：干旱脅迫；柴胡；酶活性；柴胡皂苷

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.017

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）05-0071-05

Effects of Drought Stress on Activity of Key Enzyme in Saikosaponin Biosynthesis Passway and Saponins Content in Bupleurum chinense HAN Xiao-wei1， FENG Hong2， FENG Jian-ming1， YAN Yu-ping1， ZHANG Dan1， ZHENG Kai-yan1， ZHENG Yu-guang1 （1. Hebei University of Chinese Medicine， Shijiazhuang 050200， China； 2. Anguo Digital Materia Medica Testing Center Co.， LTD.， Anguo 071200， China）

Abstract： Objective To research the effects of drought stress on activity of key enzyme in saikosaponin biosynthesis and saponins content in Bupleurum chinense； To reveal response of Bupleurum chinense to drought stress from protein level. Methods Bupleurum chinense was cultivated in potted water control experiment with 70%–80%， 60%–70%， 40%–50% and 20%–30% saturated soil water contents. The enzyme activities of 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A reductase （HMGR）， isoprenyl-based coke （IPPI）， farnesyl pyrophosphate synthase （FPS） and β-carotenoid synthase （β-AS） of six months and one year old Bupleurum chinense were measured. The contents of saikosaponins a and d in samples of different soil water contents were determined by HPLC. Results When the saturated moisture was 40%–50%， the enzymatic activities of HMGR， IPPI， FPS and β-AS were the highest， followed by saturated moisture 60%–70%、70%–80% and 20%–30%. The trend of saikosaponin was similar to that of the activity of key enzyme. Conclusion 40%– 50% soil saturated water content can significantly increase the activity of the key enzymes in the saikosaponin synthesis pathway. The saponin content and enzyme activity show a significant positive correlation， indicating that under drought stress， Bupleurum chinense regulates the synthesis of saikosaponin by regulating the key enzyme activity of saikosaponin synthesis pathway to respond drought stress.

Key words： drought stress； Bupleurum chinense； activity of enzyme； saikosaponin

柴胡Bupleurum chinense DC.為傘形科柴胡屬植物，是《中華人民共和國藥典》規定的藥用柴胡主要來源之一[1]。柴胡所含的主要有效成分柴胡皂苷是一種齊墩果烷類型的三萜皂苷，主要為柴胡皂苷a和柴胡皂苷d。柴胡皂苷屬于次生代謝產物，是柴胡抵御脅迫的產物，也是主要的藥效成分[2-3]。柴胡皂苷合成的途徑主要由3部分組成[4]，首先合成前體物質異戊烯焦磷酸（IPP）、二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP）、法呢基焦磷酸（FPP），在此基礎上合成2，3-角鯊烯氧化物環化合成齊墩果烷型或達瑪烷型三萜骨架，最后是三萜類骨架在細胞色素P450、糖基轉移酶和糖苷酶等酶的修飾下形成皂苷[5-6]。在上述過程中，HMG-CoA還原酶（HMGR）催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）生成甲羥戊酸（MVA），MVA在MVA激酶、磷酸MVA激酶和脫羧酶的作用下形成IPP，異戊烯焦磷酸異構酶（IPPI）催化IPP和DMAPP之間的可逆轉化，法呢基焦磷酸合酶（FPS）催化FPP的形成，β香樹脂合成酶（β-AS）催化形成β-香樹素[7]，這些酶均為柴胡皂苷合成途徑中關鍵的限速酶。

干旱是影響植物生長、生存和分布的重要環境因子之一。柴胡主要分布在我國干旱和半干旱地區，目前，隨著全球暖干化，干旱脅迫普遍存在，而且呈現出加劇的趨勢，因此，研究柴胡對干旱脅迫的響應機理就顯得尤為重要。黃璐琦等[8]研究逆境脅迫對藥材的作用后提出了道地藥材形成的逆境效應理論，即藥用植物在適度的逆境下可以提高其藥效成分的積累。近年來，國內外對柴胡的研究主要集中在柴胡的藥理作用[9]、真偽鑒定[10-15]和栽培[16]等方面，而對柴胡干旱脅迫下的分子響應機制研究較少，因此，本研究通過設置土壤的含水量人為模擬干旱條件，探討干旱脅迫對柴胡皂苷合成途徑關鍵酶活性的影響，從而為進一步研究干旱脅迫對柴胡皂苷積累的影響奠定基礎。

1 儀器與試藥

GL-20G-II型冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；EPOCH酶標儀購自美國伯騰儀器公司；Eppendorf移液槍；MGC-P型光照培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；賽默飛OMS100烘箱；沃特世2695高效液相色譜系統。

植物HMGR、β-AS、FPS和IPPI酶聯免疫分析試劑盒（批號均為201512），上海酶聯生物科技有限公司；柴胡皂苷a對照品（批號110777-201510）、柴胡皂苷d對照品（批號110778-201510），中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，氨水、甲醇為分析純。

6個月和1年生柴胡幼苗，河北省邯鄲市涉縣農牧局提供，經河北中醫學院鄭玉光教授鑒定為北柴胡Bupleurum chinese DC.。

2 方法

2.1 植物材料的處理

選取生長良好整齊的柴胡苗，移栽到花盆中，花盆口徑29 cm、底徑19 cm、高20 cm、質量295 g，每個花盆下有一塑料托盤。土壤為沙壤土、營養土和蛭石按1∶1∶1混合均勻。6個月和1年生柴胡幼苗分別于2015年12月和2016年5月移栽于盆中，每盆4穴，每穴2株。移栽后正常澆水，生長1個月后，選取正常生長、一致的幼苗作為供試材料。

采用單因素完全隨機區組試驗設計，分別設置土壤飽和含水量的70%～80%、60%～70%、40%～50%、20%～30%共4個水平，采用稱重法進行水分控制。控水期間每日17：00稱取盆重，補充失去的水分，使各處理保持設定的相對含水量。每處理設置3個重復，控水處理1個月后采集樣品測定各指標。

2.2 酶聯免疫法檢測4種酶活性

2.2.1 原理及方法 采用雙抗體夾心法測定樣品中HMGR、IPPI、FPS和β-AS的酶活性。以FPS為例，用純化的植物FPS抗體包被微孔板，制成固相抗體，向包被單抗的微孔中依次加入植物FPS，再與辣根過氧化物酶（HRP）標記的FPS抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色，顏色深淺與樣品中的植物FPS呈正相關。用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度（OD）值，通過標準曲線計算樣品中植物FPS活性。HMGR、IPPI和β-AS活性測定方法與FPS相同。

2.2.2 粗酶的提取 將柴胡種苗從土壤中取出，用水沖洗數遍去除泥沙，再用吸水紙吸干多余水分，并去除莖葉部分，用電子天平準確稱量每棵柴胡種苗根部的質量，按質量體積比1∶18加入0.01 mol/L PBS（pH 7.15），冰浴研磨成勻漿，放置冰箱浸提2 h，4 ℃、10 000 r/min離心20 min，去除沉淀取上清，重復上述步驟，離心后取上清。

2.2.3 酶活性測定 將試劑盒提供的原倍標準品分別稀釋為60、30、15、7.5、3.75 IU/L。加樣：分別設空白孔（不加樣品及酶標試劑，其余操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準孔準確加樣50 ?L，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 ?L，再加待測樣品10 ?L（樣品最終稀釋度為5倍）。將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。溫育：用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復5次，拍干。加酶：每孔加入酶標試劑50 ?L，空白孔除外。溫育（同上）。洗滌（同上）。顯色：每孔先加入顯色劑A 50 ?L，再加入顯色劑B 50 ?L，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min。終止：每孔加終止液50 ?L（此時藍色立轉黃色）。測定：以空白孔調零，450 nm波長依序測量各孔OD值。測定應在加終止液后15 min內進行。

2.2.4 數據處理 以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線，計算直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

2.3 HPLC測定柴胡皂苷a、d含量

皂苷含量測定條件參照2015年版《中華人民共和國藥典》，方法參照張宇等[4]步驟進行。

3 結果

3.1 干旱對柴胡皂苷a、d含量的影響

不同土壤飽和含水量處理的6月齡和1年生柴胡苗柴胡皂苷a、d含量見圖1。在干旱脅迫下，土壤飽和含水量為40%～50%時，6月齡和1年生柴胡苗柴胡皂苷a、d含量最高，土壤飽和含水量為60%～80%時次之，土壤飽和含水量為20%～30%時最低。說明適度干旱脅迫可以使柴胡皂苷a、d的積累量增加。

3.2 干旱對柴胡皂苷合成途徑關鍵酶活性的影響

3.2.1 酶活性測定標準曲線 6月齡和1年生柴胡苗的FPS、β-AS、HMGR和IPPI酶活性檢測具有不同的標準曲線，回歸方程見表1。標準曲線的r2均為0.99左右，說明后續結果可信。

3.2.2 酶活性測定結果 6月齡柴胡苗β-AS的酶活性最高，達到20 000 IU/g左右；IPPI的酶活性較低，只有250 IU/g左右。在干旱處理條件下，40%～50%土壤飽和含水量使FPS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性達到最高，而土壤飽和含水量在70%～80%與60%～70%的情況下FPS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性相差不大，而當土壤飽和含水量降到20%～30%時，FPS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性明顯降低。結果見圖2。

1年生柴胡苗在干旱脅迫條件下，土壤飽和含水量40%～50%時，FPS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性較高，而土壤飽和含水量70%～80%與60%～70%的情況下酶活性相差不大，土壤飽和含水量20%～30%時，FPS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性較低。結果見圖3。

以上結果說明柴胡皂苷合成途徑關鍵酶FPS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性在適度干旱條件下較高，水分過多或過少都會對酶活性產生不良的影響。

3.3 柴胡皂苷含量與酶活性的相關性

采用SPSS19.0軟件分析不同處理下柴胡皂苷含量與HMGR、IPPI、FPS和β-AS酶活性的相關性，結果見表2、表3。6月齡苗的HMGR、IPPI、FPS和β-AS酶活性與柴胡皂苷a、d含量呈極顯著的正相關（P<0.01）；1年生柴胡苗HMGR、IPPI、FPS和β-AS酶活性與柴胡皂苷a含量呈極顯著的正相關（P<0.01），與柴胡皂苷d的表達呈顯著正相關（P<0.05）。6月齡和1年生柴胡苗的HMGR、IPPI、FPS和β-AS酶活性之間均呈極顯著的正相關（P<0.01），說明作為柴胡皂苷合成途徑的關鍵酶，每種酶的表達都與其下游酶活性相關，4種酶統一協調柴胡皂苷的合成過程。

4 討論

張宇等[4]發現干旱脅迫能使HMGR、IPPI、FPS和β-AS的基因表達量上升，而基因表達的產物就是酶類，但基因表達升高并不一定代表酶活性的升高，酶活性能更直接地反映干旱脅迫與柴胡皂苷之間的關系。本研究結果表明，6月齡柴胡苗的酶活性雖然較1年生柴胡苗的酶活性低很多，但在干旱處理下其變化趨勢是一致的。6月齡柴胡苗的HMGR酶活性約為1200 IU/g，而1年生柴胡苗的HMGR酶活性達到5000 IU/g，而且，無論是6月齡苗還是1年生苗其β-AS酶活性均明顯高于另外3種酶，1年生苗的β-AS酶活性達到80 000 IU/g，較其他3種酶活性高出1個數量級。這說明隨著外界溫度的升高，柴胡皂苷的合成也在加速，另外，β-AS作為最靠近終產物的酶類，其活性在某種程度上代表了柴胡皂苷合成的多少。

6月齡和1年生柴胡苗對于干旱脅迫的響應趨勢是一致的，在土壤飽和含水量為40%～50%時，FPS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性最高，土壤飽和含水量60%～70%與土壤飽和含水量70%～80%時的4種酶活性大致相當，土壤飽和含水量40%～50%應該是酶活性的最適水分。但是，干旱脅迫對于酶活性的增加是有限的，當土壤飽和含水量降至20%～30%時，酶活性迅速降低。在干旱脅迫下，柴胡皂苷含量的變化趨勢與酶活性一致，說明柴胡皂苷含量的提高需要一定的干旱期。

另外，β-AS作為最靠近皂苷生成的酶，在干旱脅迫下其活性上調最明顯，4種酶的活性呈顯著正相關，說明上游酶類影響著下游酶類的表達，呈現逐級遞增的趨勢，積累到一定程度，就會表現為柴胡皂苷含量的增加。相關性分析也表明，4種酶的表達與柴胡皂苷的含量呈極顯著的正相關。由此可知，適度的干旱脅迫能夠促進柴胡皂苷合成途徑關鍵酶的表達，進而影響柴胡皂苷的積累。

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