HPLC同時(shí)測(cè)定盆炎凈膠囊中3種有效成分含量

袁志鷹 楊巖濤 李榮東 李哲 歐陽吉德

摘要：目的 建立HPLC同時(shí)測(cè)定盆炎凈膠囊中3種有效成分芍藥苷、原兒茶酸和綠原酸的含量分析方法。方法 采用SHIMADZU VP-ODS-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），流動(dòng)相為乙腈-0.15%磷酸溶液梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)231、255、326 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 ?L。結(jié)果 在上述色譜條件下，芍藥苷、原兒茶酸、綠原酸之間分離度良好。芍藥苷Y=1546.412 8X+127.075 6（r=0.999 9），線性范圍150.054～1254.50 ng；原兒茶酸Y=2925.846 8X+2204.107 6（r=0.999 8），線性范圍162.33～1352.75 ng；綠原酸Y=893.904 5X-261.731 5（r=0.999 4），線性范圍11.43～95.25 ng。3種成分的平均回收率分別為97.60%、102.09%、98.52%。結(jié)論 該方法操作簡(jiǎn)單、方便、準(zhǔn)確，可為盆炎凈膠囊的質(zhì)量控制提供借鑒。

關(guān)鍵詞：盆炎凈膠囊；芍藥苷；原兒茶酸；綠原酸；高效液相色譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.019

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）05-0082-04

Simultaneous Contents Determination of Three Active Ingredients in Penyanjing Capsules by HPLC YUAN Zhi-ying1， YANG Yan-tao1， LI Rong-dong1， LI Zhe1， OUYANG Ji-de2 （1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 2. Chenzhou Institute for Food and Drug Control， Chenzhou 423000， China）

Abstract： Objective To establish an HPLC method for simultaneous contents determination of paeoniflorin， protocatechuic acid and chlorogenic acid in Penyanjing Capsule. Methods The chromatographic separation was performed on a SHIMADZU VP-ODS-C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 ?m）； the column temperature was maintained at 30 ℃； A gradient elution of acetonitrile-0.15% phosphoric acid aqueous solution was adopted at the flow rate of 1.0 mL/min； The UV detection wavelengths were at 231， 255， and 326 nm； The injection volume was 20 ?L. Results Paeoniflorin， protocatechuic acid and chlorogenic acid could be separated efficiently with this condition. The regression equation was Y=1546.412 8X+127.075 6 （r=0.999 9）， Y=2925.846 8X+2204.107 6 （r=0.999 8）， Y=893.904 5X-261.731 5 （r=0.999 4）， respectively. Paeoniflorin， protocatechuic acid and chlorogenic acid were linear in the range of 150.054–1254.50 ng， 162.33–1352.75 ng， 11.43–95.25 ng， and the average recoveries were 97.60%， 102.09% and 98.52%. Conclusion The method is simple， convenient and accurate， which can be used to the quality control of Penyanjing Capsule.

Key words： Penyanjing Capsule； paeoniflorin； protocatechuic acid； chlorogenic acid； HPLC

盆炎凈膠囊是在盆炎凈顆粒（衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-2387-97）的基礎(chǔ)上改變劑型而成，由忍冬藤、蒲公英、雞血藤、益母草、狗脊、車前草、赤芍、川芎共8味藥組成，具有清熱利濕、和血通絡(luò)、調(diào)經(jīng)止帶之功效，適用于濕熱下注、白帶過多等婦科帶下病，是臨床常用中成藥之一，療效確切[1]，且未見明顯不良反應(yīng)。但現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBZ23722005）較為簡(jiǎn)單，只有部分藥材的薄層定性鑒別，難以整體控制藥品質(zhì)量。芍藥苷為赤芍的定量指標(biāo)成分[2]；君藥忍冬藤和蒲公英具有較強(qiáng)的抗菌作用，其抗菌有效成分以綠原酸為主[3]；原兒茶酸是忍冬藤、雞血藤、狗脊、川芎、車前草等多種藥材中的主要活性成分[4-8]。以上3種成分均具有較強(qiáng)的生理活性。采用HPLC單獨(dú)測(cè)定芍藥苷[9-10]、原兒茶酸[11]、綠原酸[3]含量的方法均已建立，但尚無同時(shí)測(cè)定3種成分含量的方法。因此，為全面控制盆炎凈膠囊質(zhì)量，提高分析檢測(cè)效率，本研究嘗試建立同時(shí)測(cè)定芍藥苷、原兒茶酸、綠原酸3種主要藥效活性物質(zhì)含量的HPLC方法。

1 儀器與試藥

島津LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司），島津SPD-M20A二極管陣列DAD檢測(cè)器，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，METTLER TOLEDO ML204電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司），KQ-300DE超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)110736-201539）、原兒茶酸對(duì)照品（批號(hào)110809- 201205）、綠原酸對(duì)照品（批號(hào)110753-201415），中國(guó)食品藥品檢定研究院。盆炎凈膠囊（湖南東潤(rùn)聯(lián)合制藥有限公司，批號(hào)分別為20140302、20140415、20151221、20150524、20151213、20141105、20150126）；乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為SHIMADZU VP-ODS-C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動(dòng)相A為乙腈，B為0.15%磷酸溶液，梯度洗脫（見表1）；流速：1.0 mL/min；波長(zhǎng)：231、255、326 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 ?L。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱定芍藥苷、原兒茶酸和綠原酸對(duì)照品適量，置于同一量瓶中，加乙腈溶解稀釋，制成每1 mL含芍藥苷250.90 ?g、原兒茶酸270.55 ?g和綠原酸19.05 ?g的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取盆炎凈膠囊內(nèi)容物約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，濾液過微孔濾膜（0.45 ?m），取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液制備

忍冬藤、蒲公英、雞血藤、狗脊、車前草、赤芍、川芎中均含有芍藥苷、原兒茶酸和綠原酸3種有效成分中的1種或多種，故按處方配比制成只有益母草（缺忍冬藤、蒲公英、雞血藤、狗脊、車前草、赤芍、川芎）的陰性樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.5 專屬性試驗(yàn)及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，混合對(duì)照品與供試品溶液中3種有效成分達(dá)到基線分離，色譜圖見圖1。芍藥苷、原兒茶酸、綠原酸各色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均>1.5，理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)均>3000。

2.6 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對(duì)照品溶液300、500、1000、1500、2000、2500 ?L，分別置于10 mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻。在上述色譜條件下，吸取各濃度混合對(duì)照品溶液20 ?L注入高效液相色譜儀，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，混合對(duì)照品進(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：芍藥苷（λ=231 nm）Y=1546.412 8X+127.075 6（r=0.999 9），線性范圍150.054～1254.50 ng；原兒茶酸（λ=255 nm）Y=2925.846 8X+2204.107 6（r=0.999 8），線性范圍162.33～1352.75 ng；綠原酸（λ=326 nm）Y=893.904 5X-261.731 5（r=0.999 4），線性范圍11.43～95.25 ng。

2.7 精密度考察

取同一對(duì)照品溶液20 ?L，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜峰峰面積，芍藥苷、原兒茶酸和綠原酸色譜峰峰面積的RSD分別為0.7%、0.4%、0.5%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.3”項(xiàng)下方法重復(fù)制備5份同一批號(hào)的供試品溶液，分別進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰峰面積，芍藥苷、原兒茶酸和綠原酸色譜峰峰面積的RSD分別為1.5%、1.3%、1.9%。表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液20 ?L，在上述色譜條件下，分別在0、2、4、6、12 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰峰面積，芍藥苷、原兒茶酸和綠原酸色譜峰峰面積的RSD分別為1.3%、1.0%、1.2%。表明3種有效成分在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取已知含量的盆炎凈膠囊樣品6份（每份內(nèi)容物0.1 g），精密加入2.0 mL混合對(duì)照品溶液（相當(dāng)于芍藥苷501.80 ?g、原兒茶酸541.10 ?g、綠原酸38.10 ?g），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)計(jì)算，加樣回收率分別為97.60%、102.09%、98.52%，RSD分別為1.39%、1.53%、1.12%，表明回收率良好。結(jié)果見表2。

2.11 樣品測(cè)定

分別精密稱取10份不同批號(hào)的盆炎凈膠囊，每份約0.2 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，各被測(cè)組分與共存組分實(shí)現(xiàn)基線分離，采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中各成分的含量，結(jié)果見表3。

表3 盆炎凈膠囊中各成分含量測(cè)定（mg/g）

3 討論

本試驗(yàn)根據(jù)芍藥苷、原兒茶酸和綠原酸的性質(zhì)，對(duì)供試品溶液的制備方法進(jìn)行了條件篩選。提取溶劑比較了純甲醇、75%甲醇、50%甲醇、95%乙醇、75%乙醇、50%乙醇、水等的提取效果，結(jié)果表明，甲醇提取效果比乙醇好，而甲醇3個(gè)濃度的提取效果相近，考慮到成本，選定50%甲醇作為提取溶劑；提取方式比較了超聲和回流對(duì)提取效果的影響，結(jié)果顯示，超聲提取效率優(yōu)于回流提取；提取時(shí)間比較了超聲15、30、60 min對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果顯示，超聲提取30、60 min的效果相近，均明顯優(yōu)于15 min提取效果，綜合能量消耗及生產(chǎn)效率等因素，選定提取時(shí)間30 min。因此，最終選擇50%甲醇作為提取溶劑，超聲提取30 min制備供試品溶液。

本試驗(yàn)對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)選，采用二極管陣列檢測(cè)器在波長(zhǎng)200～400 nm范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)芍藥苷在231 nm、原兒茶酸在255 nm、綠原酸在326 nm處有最大吸收，為提高分析方法的靈敏度，減少干擾，本研究采用多波長(zhǎng)檢測(cè)方法；考察不同色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）、Phenomenex Gemini C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）和SHIMADZU VP-ODS-C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）的峰形、柱效和分離度，結(jié)果顯示，以SHIMADZU VP-ODS-C18為最佳；試驗(yàn)比較了乙腈-水、乙腈- 0.15%磷酸、甲醇-水、甲醇-0.15%磷酸等不同比例的流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果表明，以乙腈-0.15%磷酸為流動(dòng)相梯度洗脫，基線平穩(wěn)，供試品各成分峰保留時(shí)間適中，分離度和峰形最佳。最終優(yōu)選色譜條件為：SHIMADZU VP-ODS-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流動(dòng)相為乙腈-0.15%磷酸水溶液，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)分別為231、255、326 nm，柱溫30 ℃。在此條件下，基線平穩(wěn)，分離效果好，因此所建立的方法能同時(shí)準(zhǔn)確測(cè)定芍藥苷、原兒茶酸和綠原酸的含量。

對(duì)盆炎凈膠囊樣品的測(cè)定結(jié)果表明，7個(gè)批次中均含有芍藥苷、原兒茶酸和綠原酸，其中芍藥苷和原兒茶酸含量比綠原酸高，但不同批次樣品的3種成分含量有一定的差異，可能與藥材及工藝流程有關(guān)，需進(jìn)一步探討。本研究建立了同時(shí)測(cè)定盆炎凈膠囊中芍藥苷、原兒茶酸和綠原酸含量的分析方法，方法簡(jiǎn)單、方便、準(zhǔn)確，可為盆炎凈膠囊、盆炎凈顆粒及相關(guān)藥材的質(zhì)量控制提供借鑒。

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