紙層析法分離鑒定氨基酸實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)

陳倩劉晶張璐

（1西北大學(xué)現(xiàn)代學(xué)院，陜西 西安 710130 2西安外事學(xué)院，陜西 西安710077）

紙層析法分離鑒定氨基酸實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)

陳倩1劉晶2張璐1

（1西北大學(xué)現(xiàn)代學(xué)院，陜西 西安 710130 2西安外事學(xué)院，陜西 西安710077）

1 儀器與試劑

儀器：定性濾紙，點(diǎn)樣毛細(xì)管，電吹風(fēng)，500 mL燒杯，培養(yǎng)皿，鑷子。

試劑：各種試劑均為分析純。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取氨基酸250 mg溶于50 mL 0.01 mol.L-1的HCl溶液中

氨基酸混合樣品液：各量取2mL的賴氨酸溶液，苯丙氨酸溶液，甘氨酸溶液，脯氨酸溶液和亮氨酸溶液，于小燒杯中充分混合均勻。

擴(kuò)展劑：95%乙醇:水=7:3（v:v），稱取茚三酮200 mg溶于

200 mL按比例配置好的乙醇水溶液中。

茚三酮可溶于乙醇和水，因此直接將茚三酮溶解在展層劑中，擴(kuò)展劑沿濾紙向上移動(dòng)，茚三酮也隨之向上移動(dòng)，層析結(jié)束后，溶劑前沿以下的部分均勻分布著擴(kuò)展劑和茚三酮，氨基酸則因分配系數(shù)的不同而在紙上分離，加熱后在氨基酸所在位置即可顯出色斑。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

（1）點(diǎn)樣：取濾紙（定性濾紙裁成7.2×11cm）1張，距一端2cm處用鉛筆輕輕的劃線，然后在線上分別用0.5%賴氨酸、

0.5 %苯丙氨酸、0.5%甘氨酸、0.5%亮氨酸溶液、0.5%脯氨酸溶液及氨基酸混合樣品溶液均勻點(diǎn)樣，每點(diǎn)點(diǎn)2-3次，每次點(diǎn)樣完成后用吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)吹干，每點(diǎn)在紙上擴(kuò)散的直徑最大不超過5 mm。

（2）展層：燒杯中加入配好的展層劑厚度約1.5 cm（體積約50 mL），將點(diǎn)好樣的濾紙豎直放入，點(diǎn)樣端朝下，展層時(shí)間2 h。

（3）烘干、顯色：展層結(jié)束后，取出濾紙，用鉛筆標(biāo)記溶劑前沿，電吹風(fēng)熱風(fēng)吹干約2-3 min。待各斑點(diǎn)顯色后，用鉛筆輕輕描出斑點(diǎn)輪廓。

（4）標(biāo)記斑點(diǎn)中心，用直尺測(cè)量斑點(diǎn)中心至點(diǎn)樣線間的距離及溶劑前沿至點(diǎn)樣線間的距離。計(jì)算各點(diǎn)比移值。

圖1 紙層析結(jié)果

3 結(jié)果和討論

3.1 結(jié)果分析(見圖1)

1.0.5 %賴氨酸溶液2.0.5%苯丙氨酸溶液3.0.5%甘氨酸溶液

4.0.5 %亮氨酸溶液5.0.5%脯氨酸溶液6.氨基酸混合液

說明：該圖為實(shí)驗(yàn)后隔天拍攝，斑點(diǎn)輪廓已擴(kuò)散。

賴氨酸 Rf1=1.0/7.1=0.14（文獻(xiàn)[1]值：0.03）

苯丙氨酸 Rf2=4.7/7.1=0.66（文獻(xiàn)[1]值：0.63）甘氨酸 Rf3=2.7/7.1=0.38（文獻(xiàn)[1]值：0.43）亮氨酸 Rf4=5.7/7.1=0.80（文獻(xiàn)[1]值：0.61）脯氨酸 Rf5=4.4/7.1=0.62（文獻(xiàn)[1]值：0.35）混合液中各點(diǎn)的比移值：

A點(diǎn)的Rf=1.0/7.1=0.14與賴氨酸比移值相同B點(diǎn)的Rf=2.6/7.1=0.37與甘氨酸比移值相近C點(diǎn)的Rf=4.8/7.1=0.68與苯丙氨酸比移值相近D點(diǎn)的Rf=5.8/7.1=0.82與亮氨酸比移值相近判斷氨基酸混合液中可能含有賴氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，亮氨酸。

各氨基酸比移值與文獻(xiàn)值不同，應(yīng)是使用的濾紙性質(zhì)差異引起的。

3.2 改進(jìn)后的優(yōu)點(diǎn)

(1)提高分離效果，顯色均勻，色斑清晰。以往向?yàn)V紙上噴布茚三酮溶液的操作，由于霧滴分布不均，容易出現(xiàn)色斑顯色不均，甚至被沖散的現(xiàn)象，不易判斷斑點(diǎn)中心，影響氨基酸Rf值，改進(jìn)后的方法解決了這一問題。

(2)簡(jiǎn)化操作步驟，節(jié)省大量?jī)x器設(shè)備，節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間。準(zhǔn)備時(shí)不用單獨(dú)配制顯色液，不用準(zhǔn)備烘箱，喉頭噴霧器，層析缸，針線等儀器設(shè)備。本實(shí)驗(yàn)使用濾紙大小為7.2cm*11cm（文獻(xiàn)[1]中為28cm*28cm），濾紙使用量明顯減少。操作中省去了噴布茚三酮溶液的操作步驟和層析缸內(nèi)溶劑平衡的步驟，大大節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，使操作更加簡(jiǎn)便易行。

(3)節(jié)省試劑，節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。原方法將顯色劑茚三酮配成

0.5 %的濃度，而本方法改進(jìn)后將其配成0.1%，減少了茚三酮用量。

(4)避免使用刺激性氣味較大、水溶性較差的正丁醇，避免使用毒性和腐蝕性較大的苯酚，改用能與水任意比例互溶的乙醇，使得展開劑體系更均一，展開效果更好。采用毒性較小的溶劑代替原有毒性較大的溶劑，符合綠色化學(xué)的要求。

[1]陳雅蕙等[M]生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法(第二版)，北京大學(xué)出版社，2005.8：222-223；

[2]田明，高崢，蘇英華等，氨基酸紙層析實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步探討[J]實(shí)驗(yàn)室科學(xué)，2009（6）：64。

Improvement of Separation and
Identification of Amino Acids by Paper
Chromatography

Chen Qian，Liu Jing，Zhang Lu
(Modern College of Northwest University，Xi’an 710130，China Xi'an International University，Xi’an 710077，China)

紙層析法分離鑒定氨基酸是制藥工程專業(yè)本科必修實(shí)驗(yàn)課，文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)方法存在實(shí)驗(yàn)時(shí)間過長(zhǎng)、溶劑毒性大等缺點(diǎn)。通過實(shí)驗(yàn)對(duì)展開劑進(jìn)行選擇,得出展開劑的最佳配比，并在此條件下對(duì)賴氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸和脯氨酸等進(jìn)行了分離和鑒定,取得了較好的分離結(jié)果。該方法與文獻(xiàn)相比，簡(jiǎn)化操作步驟，節(jié)約儀器試劑，節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，使用毒性較小的溶劑，符合綠色化學(xué)的要求。

紙層析法；氨基酸；比移值；綠色實(shí)驗(yàn)

The paper chromatography separation of amino ac?ids is a compulsory biological experiment for undergraduate major in pharmaceutical engineering.But some shortcomings,such as a long duration，toxicity of the solvent,exist in this experiment. This study conducted the influence factors，obtained the best ratio of the expansion agent.We isolated and identified lysine,phenylal?anine,glycine,leucine and proline under this condition.It showed a better separation effect.Compared with the method in literature, the improved paper chromatography has the advantage of more simple steps,less agent dose and instrument,shorter separate time，more obvious separate effect,less toxic solvents,which conforms to the green chemistry request.

Paper chromatography；Amino acid；Rf Value；Green experiment

陳倩（1986-），女，陜西楊凌人，西北大學(xué)現(xiàn)代學(xué)院教師，主要研究方向：化工與制藥（藥物合成）。