拉鏈型脂肽的溫控開關效應

王斯佳 李夢雅 徐首紅 劉洪來

拉鏈型脂肽的溫控開關效應

王斯佳§李夢雅§徐首紅*劉洪來

(華東理工大學化學與分子工程學院，結構可控先進功能材料及其制備教育部重點實驗室，上海200237)

亮氨酸拉鏈型脂肽是由兩條肽鏈以螺旋結構依靠疏水作用并列結合形成的二聚體，當溫度升至其相變溫度時，其螺旋結構解旋繼而變為無序鏈狀結構。利用該類脂肽的溫敏性能，本文設計、合成得到一組具有溫敏性的拉鏈型脂肽，將其與磷脂混合制備溫敏性脂質體。用圓二色譜測定磷脂雙分子層上脂肽的二級結構，動態光散射測定脂肽-脂質體的粒徑及電位；熒光偏振法測定脂質體膜的流動性；采用紫外分光光度計考察阿霉素(DOX)在37.0、45.0°C下的釋放行為。結果表明，含有脂肽的脂質體具備較好的溫敏性，膽固醇含量、脂質體膜的流動性，對脂肽的溫控開關效應有一定的影響。脂肽-脂質體作為一種新型的溫敏性藥物載體展現了其較好的應用前景。

亮氨酸；拉鏈型脂肽；脂質體；溫敏性；藥物載體

1 引言

脂質體由于其具備良好的生物相容性和被動靶向性，從而被廣泛用作于藥物載體1－3。然而，傳統的脂質體可以通過各種途徑進入血液循環，這大大降低了藥物的功效，并且增加了其對健康組織及器官的危害性。因此，為了克服傳統脂質體的這些缺點，近年來，研究者對傳統脂質體進行修飾，得到了一些新型的脂質體，如光敏感脂質體4,5，pH敏感脂質體6,7及溫度敏感脂質體8,9等。

腫瘤的治療是醫藥界關注的重點之一10－13。傳統化療法不能實現高效的局部治療，對健康的細胞或組織也會造成不同程度的損害。然而溫度敏感脂質體可以在局部受熱部位實現快速釋藥，從而具備了熱靶向性，進而提高藥物的利用率。于是，本文旨在設計研究新型的溫度敏感脂質體，將其與腫瘤熱療相結合，實現更強的靶向性及控釋特性，以提高腫瘤治療效果。

亮氨酸拉鏈肽14是由特定的氨基酸序列組成，亮氨酸在每7個氨基酸中出現一次。在一定的溫度條件下其可以形成一個超螺旋盤繞線圈，并通過疏水作用力結合而成二聚體的立體結構。當升高溫度至其熔融溫度時，盤旋的線圈發生解離，形成無序的肽單體15,16。亮氨酸拉鏈肽響應熱的構型變化的性質使其成為修飾溫度敏感脂質體的一個備受關注的組分17。

本文設計、合成得到三種具備螺旋結構的雙親性脂肽：C6-28AA(Lp1)，C10-28AA(Lp2)和C8-30AA(Lp3)，并將其與磷脂混合制備得到新型的溫度敏感脂質體(Lp-Lipo)(示意圖1)。研究它們在45.0及37.0°C條件下，包裹抗癌藥物阿霉素的藥物釋放行為；同時，研究脂質體不同膽固醇含量對脂肽溫敏性及釋藥情況的影響，進而得到一種具有最佳抗癌效果的新型溫度敏感的藥物載體。

2 實驗部分

2.1 實驗試劑

自行設計的亮氨酸拉鏈型脂肽(Lp1:CH3-(CH2)4-CO-NH-VAQLEVK-VAQLESKVSKLESKVSSLESK-COOH,Lp2:CH3-(CH2)8-CO-NH-VAQLE VK-VAQLESKVSKLESK-VSSLESK-COOH,Lp3: CH3-(CH2)6-CO-NH-AS-VAQLEVK-VAQLESKVSK ESK-VSSLESK-COOH,＞95%，杰肽生物有限公司)；二硬脂酰基磷脂酰膽堿(DSPC，＞98%，Lipoid公司)，二棕櫚酰磷酯酰乙醇胺(DPPE，＞98%，Lipoid公司)；二油酰基磷脂酰膽堿(DOPC，＞98%，Sigma-Aldrich公司)；陽離子膽固醇(Chol，＞98%，Avanti公司)；三(羥甲基)氨基甲烷(Tris-HCl，＞98%，Aladdin公司)；葡聚糖(G-50，＞95%)，阿霉素(DOX，＞98%)和1,6-二苯基-

示意圖1 脂肽的結構及脂肽-脂質體的溫控釋藥性能Scheme 1 Structure of Lp and thermo-controlled drug release of Lp-Lipo 1,3,5-己三烯(DPH，＞98%)購于百靈威科技有限公司；甲醇、氯仿等分析級別的溶劑購于國藥集團化學試劑有限公司。

2.2 脂質體的制備

單純脂質體與磷脂/脂肽的混合脂質體均利用薄膜分散法制備。首先，將一定比例的DSPC、DPPE、DOPC和Chol溶于氯仿/甲醇(體積比為2:1)的混合溶液，并加入至250 mL的圓底燒瓶中；若制備的是混合脂質體，需在該混合溶液中加入脂肽。然后利用旋轉蒸發儀(N-1001，上海愛朗儀器有限公司)將溶劑除去，得到脂質薄膜。加入5 mL的Tris-HCl緩沖溶液(10 mmol·L－1，pH=7.4)，48.0°C條件下利用超聲儀(KQ-100TDB，昆山市超聲儀器有限公司)超聲30 min得到濃度6 mmol·L－1的脂質體樣品。最終，利用含有200 nm聚碳酸酯濾膜的擠壓器(LiposoFast-Basic，Avestin，加拿大)對樣品進行11次過濾，最終得到粒徑小于200 nm且分布均勻的樣品。

2.3 動態光散射(DLS)

脂質體樣品的粒徑、多分散指數及表面電荷均利用動態光散射(Zetasizer Nano-ZS，馬爾文，英國)測量得到，其中多分散指數反映了粒徑分布的集中程度。

2.4 透射電子顯微鏡(TEM)

將20 μL磷鎢酸附染后的脂質體樣品加入至銅網上，待樣品烘干后，采用透射電子顯微鏡(JEM-1400，JEOL，日本)對樣品進行觀察測量。

2.5 圓二色譜(CD)

圓二色譜是利用分光光度計(Chirascan，Applied Photophysics Ltd，英國)來測量多肽類物質的二級結構18,19，其中含有一個熱電溫度控制系統。利用圓二色譜對含有脂肽的混合脂質體(脂肽濃度固定為50 μmol·L－1)樣品進行了一系列不同溫度下的構象測量。將含有脂肽的樣品加入至規格為2 mm的石英比色皿，掃描范圍設定為260至190 nm，以1°C·min－1的速率從20.0°C升溫至70.0°C，每增加2.0°C記錄一次數據，得到最終的響應溫度變化的圓二色譜圖。嵌入在脂質體上的脂肽的相變溫度Tm通過光物理學軟件Glob3分析計算得到。

2.6 熒光各向異性

選擇疏水性分子1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)作為熒光探針以檢測磷脂雙分子層的流動性20,21。配置溶液濃度為2×10－7mol·L－1的DPH溶液，將其以n(lipids):n(DPH)=800:1的質量比與脂質體混合得到混合溶液，并將其放置于常溫下攪拌12 h。DPH熒光探針在脂質體上的各向異性通過熒光光度計(LS-55，PerkinElmer，美國)來測量。選擇激發波長360 nm、發射波長430 nm，且狹縫寬度均為10 nm進行測量，其中溫度是通過一個連接的恒溫水浴來控制，測量從20.0°C進行到70.0°C，每隔5.0°C記錄一次測量數據。最終的各向異性值是通過以下方程計算得到22,23：

其中，r代表各向異性。熒光發射強度定義為i，其下標vv和vh分別代表激發偏振片與發射偏振片各自的方向。其中，G是一個矯正儀器偏振度的因子，定義為ihv/ihh。

2.7 阿霉素的裝載及釋放

包裹抗癌藥物阿霉素的脂質體是通過硫酸銨梯度法制備得到。制備方法與2.2節類似，其中緩沖溶液變為硫酸銨溶液(200 mmol·L－1)；經水化得到脂質體樣品后，利用生理鹽水溶液對其進行透析10次后，將其與一定量的阿霉素溶液(2.5 mg· mL－1)混合至50°C下孵化45 min，然后利用凝膠過濾的方法將未被包裹的阿霉素除去，得到裝載阿霉素的脂質體。其中，分別取200 μL的未過濾和已過濾后的樣品與等量的曲拉通溶液加入至5 mL容量瓶定容后得到混合溶液，高溫下超聲30 min后，利用紫外分光光度計(UV)(UV-2450，島津，日本)測量兩者溶液在485 nm處的紫外吸收值，分別為A0、A1。阿霉素的包封率即為A1/A0，本研究的包封率均在80%(w)以上。

阿霉素的釋放實驗是在37.0與45.0°C下進行的。取定量的樣品放置于截留量為3500的透析袋中，外圍放置25倍體積的Tris-HCl緩沖溶液且控溫。每隔1 h，取3 mL的透析液，利用UV測量其在485 nm處的吸收值，記為At，24 h后停止測量，且每次測量結束后將透析液倒置于原處。阿霉素的累積釋放率為At/A1。

3 結果與討論

3.1 脂肽-脂質體的物性

以n(DSPC):n(DPPE):n(Chol)=2:0.1:1的比例混合制備得到空白脂質體Lipo，以n(lipid): n(lipopeptide)=100:1的比例分別加入三種脂肽Lp1、Lp2及Lp3制備得到脂肽-脂質體Lp-Lipo。利用動態光散射測量四種脂質體的粒徑、分散系數及其表面電荷，如表1所示。結果顯示，脂質體的粒徑均在200 nm左右，說明脂肽的加入并不會影響脂質體的粒徑分布，且較小的多分散指數(PDI)值證明其粒徑分布較為均一。同時，由于陽離子膽固醇的存在，使脂質體表面均帶有50 mV左右的正電荷。為了更加直觀地觀察脂質體的真實形貌及大小，利用透射電鏡對其進行表征，結果如圖1(b)所示。從圖中可以看出，脂質體是以球狀結構存在的，且粒徑大小約200 nm，結果與DLS結果一致(圖1(a))。

3.2 脂肽-脂質體的溫敏性

利用圓二色譜，測定嵌在磷脂雙分子層上的脂肽隨溫度變化的構象變化。如圖2所示，三種脂肽在20.0°C下的圓二譜圖，均具備192 nm的正峰及208、222 nm處的負峰，這是典型的α-螺旋結構，說明常溫下，在脂質體雙層膜中的三種脂肽均以雙螺旋結構存在。隨著溫度的升高，脂肽的二級結構發生變化；對于Lp1-Lipo與Lp3-Lipo，當溫度升高至70.0°C時，其螺旋含量大大降低，向無規卷曲狀轉變，其相變溫度Tm由分析軟件

表1 脂質體的粒徑、分布系數及其表面電位Table 1 Diameters,polydispersity index and

zeta-potentials of liposomes

Liposome Lipo

Lp1-Lipo Lp2-Lipo Lp3-Lipo d/nm 192.5 188.7 186.6 193.8 Zeta/mV

圖1 脂質體的粒徑分布(a)及TEM圖(b)Fig.1 Size distribution(a)and transmission electron mictroscopy(TEM)images(b)of liposomes

55.1 56.0 46.5 48.7 PDI:polydispersity PDI 0.121 0.142 0.156 0.129 Global 3計算得到，分別為45.5、45.0°C；對于Lp2-Lipo，從圖2(b)可以看出，即使在高溫條件下，Lp2依然保持螺旋狀態，此時計算得到的溫度45.4°C并不代表其真正的相變溫度。對比Lp1-Lipo與Lp2-Lipo發現，烷烴鏈的增長，大大增加了脂肽螺旋結構的穩定性，從而影響了其相變行為；對于Lp2-Lipo與Lp3-Lipo，將兩個烷烴變為兩個氨基酸(丙氨酸與絲氨酸)，降低了脂肽的穩定性，使得Lp3-Lipo在高溫下發生了更為徹底的相變。所以，烷烴鏈的長短以及氨基酸的端基修飾均會影響脂肽的二級結構的變化，烷烴鏈越長，脂肽的螺旋結構越穩定24,25；同時，在N端修飾丙氨酸與絲氨酸，會大大降低脂肽的二級結構的穩定性，從而使其具有更好的溫敏性能。

3.3 脂肽-脂質體膜的流動性

為了更好地理解磷脂分子與脂肽之間的相互作用，選擇DPH作為熒光探針，測定脂肽-脂質體隨溫度變化的脂質體膜的流動性。由于DPH為疏水性分子，所以測量得到的結果顯示了磷脂雙分子層疏水部分的擾動。結果如圖3所示，無論是空白脂質體還是脂肽-脂質體，其各向異性值均隨著溫度的升高而降低，且在52.0°C附近出現了最為顯著的變化，這是因為在此溫度范圍，磷脂分子發生了凝膠態向液晶態的轉變26。對比圖3中的四條曲線，發現，在低于脂質體的相變溫度時，脂肽的加入對脂質體膜的流動性影響不大；而隨著溫度的升高，脂肽的作用就突顯出來：Lp1與Lp3的加入增加了膜的流動性，而Lp2的加入大大提高了膜的穩定性。正如3.2節中所述，由于Lp1與Lp3在升溫過程中二級結構發生了較大的變化，從而導致其對磷脂分子的擾動，進而增加了膜的流動性；相反，由于Lp2疏水端較長的烷烴鏈，導致其二級結構較為穩定，即使在高溫條件下結構也基本不發生改變，從而抑制了周圍磷脂分子的流動，增加了脂質體膜的穩定性。

圖2 Lp1-Lipo(a),Lp2-Lipo(b)及Lp3-Lipo(c)隨溫度變化的構象變化Fig.2 Temperature-dependent conformational changes of Lp1-Lipo(a),Lp2-Lipo(b)and Lp3-Lipo(c)

圖3 DPH在空白脂質體及脂肽-脂質體中隨溫度變化的各向異性值Fig.3 Fluorescence anisotropy of DPH in Lipo and Lp-Lipo measured as a function of temperature

3.4 脂肽-脂質體的體外模擬釋藥

利用硫酸銨梯度法將抗癌藥物阿霉素包裹在脂質體內，包封率可達80%(w)。通過測量四種脂質體在37.0與45.0°C下阿霉素的累積釋放量，研究脂質體膜上脂肽的溫敏性能。如圖4所示，37.0°C時，無論是空白脂質體還是脂肽-脂質體，釋放量均較小，保持在10%(w)左右，這是因為此溫度下的脂肽分子保持螺旋結構，磷脂分子也處在凝膠態，且大量膽固醇的存在，均會使得脂質體的結構相對穩定，從而造成較少量的藥物的泄漏。但是對比發現，Lp3-Lipo的藥物泄漏量略大于空白脂質體，而Lp2-Lipo的藥物泄漏量略小于空白脂質體，此結果與3.3節中膜的流動性相一致。37.0°C下Lp3的加入降低了膜的穩定性，相反Lp2卻提高了膜的穩定性，這證明了在低溫時，藥物阿霉素的泄漏只與脂質體膜的流動性有關。而45.0°C時，脂肽-脂質體的累計釋放量均遠遠大于空白脂質體，這說明在溫熱條件下，脂肽二級結構的變化，螺旋結構的解離，在脂質體膜上形成孔道，從而大大提高藥物的釋放，證明了脂肽具有溫敏性。對比三種脂肽-脂質體的釋藥情況發現，正如圖2的圓二色譜結果所示，由于Lp2的疏水尾鏈烷烴鏈最長，疏水作用力過大，使得其兩條肽鏈很難發生相變而分離，從而導致其溫敏性較差，最終導致其作用在脂質體上的藥物釋放最少；而其中Lp3的溫敏性最好，Lp1次之，最終導致溫熱條件下Lp3-Lipo的藥物釋放量最大且最快。以上結果證明了在45.0°C條件下，脂肽-脂質體的藥物釋放主要依賴于雙層膜中嵌入的脂肽的溫敏性。綜上，脂肽-脂質體具備良好的溫敏性釋藥效果，其中Lp3-Lipo效果最佳，展現了其作為一種新型的溫敏性藥物載體的良好的應用潛能。

3.5 膽固醇對脂肽-脂質體釋藥性能的影響

膽固醇在生物膜中起著至關重要的作用，其具有雙親性，不僅可以提高脂質體的穩定性，而且與磷脂具備良好的相容性，從而起到調節脂質體膜流動性與通透性的作用，被稱為脂質體膜的“緩沖劑”27,28。為了研究膽固醇含量對脂質體膜性能和脂肽溫敏性能的影響，研究了摩爾比n(lipid): n(Chol)為8:1，4:1及2:1條件下的Lp-Lipo的體外釋藥情況。

圖4 空白脂質體及脂肽-脂質體在37.0及45.0°C條件下的釋藥動力學Fig.4 Drug release dynamic of Lipo and Lp-Lipo at 37.0 and 45.0°Csolid:45.0°C,hollow:37.0°C

圖5 45.0°C條件下DPH在含有不同膽固醇含量的脂肽-脂質體中的各向異性值Fig.5 Fluorescence anisotropy of DPH in Lp-Lipo with different amounts of Chol at 45.0°C

圖6 膽固醇含量(n(Lipids):n(Chol)=8:1/4:1/2:1)對三種脂肽-脂質體的釋藥動力學的影響Fig.6 Drug release dynamic of Lp-Lipo containing different amounts of Chol(n(Lipids):n(Chol)=8:1/4:1/2:1) solid:45.0°C,hollow:37.0°C

表2 脂肽-脂質體在37.0和45.0°C條件下24 h的藥物累積釋放量Table 2 Total release percentage of DOX from various Lp-Lipo at 37 and 45.0°C over 24 h

圖5顯示了在45.0°C條件下不同膽固醇含量的脂質體加入三種脂肽后的各向異性值。首先，從圖中可以看出，當n(lipid):n(Chol)為8:1和4:1時，其膜的流動性基本不變，而當膽固醇含量增加至n(lipid):n(Chol)=2:1時，各向異性值有較大程度的增加，說明在該實驗條件下，膽固醇含量增加至一定量時，才會對脂質體膜起到穩定的作用。然后對比每種膽固醇含量下的三種脂肽-脂質體的各向異性，發現，Lp2相較于Lp1與Lp3，具有穩定膜的功能，原因如3.2節中所述，Lp2在脂質體中發生相變后引起的自身空間結構變化最小，溫敏性最差，所以造成的擾動最小，抑制了磷脂分子的運動。總體而言，不同的脂肽分子，在不同含量的膽固醇的影響下，溫熱條件下會發生不同程度的構象變化，從而對磷脂分子的熱運動造成不同的影響。

為了更加直觀地分析膽固醇含量對于脂肽-脂質體的溫敏性釋藥的影響，分別測定了三種膽固醇含量的三種脂肽-脂質體的釋藥動力學，結果如圖6所示。表2列出了其在37.0與45.0°C下24 h后的藥物累積釋放量。首先，無論是何種組分的脂質體，45.0°C下的釋藥量均大于37.0°C的，這證明了三種脂肽均具有較好的溫敏性能，且溫敏性能較為穩定。然后對比不同膽固醇含量的脂質體之后，發現，n(Lipids):n(Chol)為4:1時的藥物釋放量均最大，與何種脂肽無關。對于n(Lipids): n(Chol)為2:1而言，正如圖5所示，膽固醇的增加，大大提高了脂質體膜的穩定性，一方面，會使得脂質體結構更加致密，減少藥物的釋放；另一方面，過于穩定的膜，會阻礙脂肽在溫熱條件下的雙螺旋結構解旋和分離，從而導致藥物釋放減少。而對于n(Lipids):n(Chol)為8:1而言，膽固醇分子較少，在溫熱條件下，磷脂分子的熱運動不會受到過多的限制，所以當脂肽螺旋結構解旋，雙鏈分離開形成孔道時，可能會因為周圍磷脂分子的易流動性而彌補孔道，從而導致藥物的釋放相對較低。顯然，n(Lipids):n(Chol)為4:1時，膽固醇作為脂質體的流動緩沖劑，既可以限制磷脂分子的劇烈運動，又不會阻礙脂肽分子的二級結構的變化。所以，當n(Lipids):n(Chol)為4:1時，有利于脂肽實現其最佳的溫敏性能。綜合以上結果分析得到，無論是脂肽分子的溫敏性(分子結構影響)，還是脂質體膜的流動性(膽固醇含量影響)，都會影響脂肽-脂質體的藥物釋放；當n(Lipids):n(Chol)為4:1，且選擇Lp3脂肽，得到的脂肽-脂質體具有最佳的溫敏性，可以實現最大最快的藥物釋放。

4 結論

設計了一系列的具有亮氨酸拉鏈結構的雙親性脂肽Lp1，Lp2及Lp3，在溫熱條件下，脂肽可以由雙螺旋結構解旋為無規則卷曲狀的單鏈，從而使其具備良好的溫敏性能。將這一系列脂肽與磷脂混合制備得到的脂肽-脂質體，一定的溫熱條件下，利用脂肽的溫敏性在脂質體膜上形成孔道，從而實現所載藥物的釋放。研究結果表明，Lp3具備最佳的溫敏性能，同時n(Lipids):n(Chol)比為4:1時，更有利于脂肽分子溫敏性的實現，得到的脂肽-脂質體可以實現最大最快的藥物釋放，這說明脂肽分子的結構以及脂質體膜的性質均會影響脂肽的溫控開關效應，進而影響脂肽-脂質體的溫敏性釋藥行為。脂肽-脂質體作為一種新型的藥物載體，具有較好的發展應用前景。且該研究也為設計新型的溫敏性藥物載體提供了良好的理論基礎。

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Thermo-Controlled On-Off Switch of Zipper-Structured Lipopeptides

WANG Si-Jia§LI Meng-Ya§XU Shou-Hong*LIU Hong-Lai
(Key Laboratory for Advanced Materials and Institute of Fine Chemicals of the Education Ministry of China,College of Chemistry and Molecular Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,P.R.China)

The leucine zipper lipopeptide is a dimer composed of two lipopeptides with α-helical structures that interact through hydrophobic forces.When heated to its phase transition temperature,the helixes unwind and form a disordered conformation.Based on the thermo-sensitivity of these leucine zipper lipopeptides,we designed and synthesized a series of zipper-structured lipopeptides and then mixed them with lipids to form thermo-sensitive hybrid liposomes.Circular dichroism was used to investigate the secondary structure of the lipopeptides anchored in the liposomal bilayer.Dynamic light scattering measurements were used to assess the diameters and zeta potentials of the liposomes.Fluorescence polarization was measured to study the fluidity of the liposomal bilayer.An ultraviolet spectrophotometer was used to stimulate Doxorubicin(DOX)release in vitro at 37.0 and 45.0°C.We found that Lp-Lipo(hybrid of lipopeptide and liposome)displayed higher thermosensitivity than pure liposome.The cholesterol content and fluidity of the liposomal bilayer affected the thermocontrolled on-off switch of the lipopeptides.Lp-Lipo shows great potential as a novel thermo-sensitive drug carrier.

Leucine;Zipper-structured lipopeptide;Liposome;Thermo-sensitivity;Drug carrier

.Email:xushouhong@ecust.edu.cn;Tel:+86-21-64251942.

§These authors contributed equally.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(21276074).國家自然科學基金(21276074)資助項目

O647

10.3866/PKU.WHXB201701062

Received:December 12,2016;Revised:January 6,2017;Published online:January 6,2017.*