假單胞菌HYS菌株對油菜種子發芽的影響

姜流+劉斌+王瑞+謝志雄

摘要：為了研究假單胞菌HYS菌株及其上清液對油菜種子發芽的作用，采用LB培養假單胞菌HYS菌株，分別用水（CK）、LB和HYS菌液浸種油菜種子或在油菜發芽過程中分別添加這3種液體。結果表明，HYS菌液浸種不影響油菜種子最終的露白和發芽，但顯著抑制油菜種子的露白和發芽進程；在油菜發芽過程中添加HYS菌液也會抑制油菜種子的露白進程，同時還抑制油菜種子的發芽和芽苗生長，而LB抑制油菜根的生長。油菜在發芽過程中，頭1～2 d感染HYS菌株則顯著抑制油菜種子的發芽，且感染時間越早其抑制效果越強，連續感染HYS菌株對油菜種子發芽和芽苗生長的抑制作用更強，且這種抑制作用主要在發芽的頭1～3 d發揮作用。將HYS菌液離心過濾除菌，用水倍比稀釋LB和上清液后培養油菜種子，發現上清液經100和1 000倍稀釋后促進油菜種子的發芽。上述結果表明假單胞菌HYS菌株在油菜種子發芽和早期生長過程中不適宜用其進行生物防治，但適當稀釋HYS上清液可促進油菜種子發芽和生長。

關鍵詞：假單胞菌（Pseudomonas sp.）；HYS菌株；油菜（Brassica napus L.）；發芽

中圖分類號：S565.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）07-1232-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.07.009

Effects of Pseudomonas sp. HYS on the Germination of Rapeseed

JIANG Liu1，2，LIU Bin1，WANG Rui1，XIE Zhi-xiong2

（1.No.1 Middle School Affiliated，Central China Normal University，Wuhan 430223，China；

2.College of Life Sciences，Wuhan University，Wuhan 430072，China）

Abstract： In order to study the effect of Pseudomonas sp. HYS on the germination of rapeseed，HYS bacteria were cultured in LB medium， and the rape seeds were soaked with water（control）， LB， and HYS culture liquid， respectively. The results showed that soaking seeds with HYS strain did not affect the split number and the number of shoots at last，but inhibited the splitting and shooting progress of rapeseed. HYS strain inhibited the splitting progress of rapeseed，the rape germination and the growth of rape shoot when the rapeseeds were contaminated with HYS strain during germination. LB inhibited the growth of rape root. HYS strain inhibited the rape germination when the rapeseeds were contaminated with HYS strain during germination of 1～2 d，earlier contamination enhanced the inhibition effect；continuous contamination reinforced the inhibition effect. However，the inhibition effect of HYS strain occurred only during 1～3 days of rape germination. Rape seeds were cultivated by diluted LB and supernatant of HYS bacteria liquid that was treated with centrifugal filter，the results showed that 100 times or 1 000 times diluents of HYS supernatant did not affect the split number of rapeseed，but accelerated rape germination and was beneficial to the growth of rape shoot. The results indicated that the Pseudomonas sp. HYS should not be used during the germination and early stage of growth in rape， however， diluted supernatant of HYS culture liquid could be used to accelerate the rape germination and promote the growth of rape shoot.

Key words： Pseudomonas sp.； HYS strain； rapeseed （Brassica napus L.）； germination

假單胞菌HYS是由武漢大學微生物實驗室從東湖水域中篩選出的一株高產鐵載體菌[1-3]，在相同培養條件下，其鐵載體產量是其他假單胞菌的5倍[1，4，5]。鐵是微生物所必需的元素，在環境中的溶解度低，假單胞菌的鐵載體可結合環境中微量的游離鐵離子，通過膜轉運至細胞，滿足其對鐵的需求[5]，假單胞菌的此生理過程可抑制不分泌或分泌低親和性鐵載體菌的生長[6，7]，因此HYS菌株的鐵載體使其具備生物防治的前景。

HYS菌株的基因組測序結果表明該菌株不存在對植物致病的分泌系統，其基因組與假單胞菌P. putida KT2440基因組相近[8]，而后者可以適應土壤、水和植物相關環境[9]，因此HYS菌株具有適應植物相關環境的能力。HYS菌株的基因組還含編碼氫氰酸和胞外蛋白酶AprA的基因，這兩段序列的蛋白產物在假單胞菌CHA0中發揮殺死秀麗隱桿線蟲和根結線蟲的作用[8]。用假單胞菌HYS菌株喂養秀麗隱桿線蟲，發現該菌株可以殺死秀麗隱桿線蟲的胚胎和成蟲[8]。

總之，菌株HYS具高效吸收鐵元素的體系，具有殺死線蟲的基因簇，能殺死秀麗隱桿線蟲，具有適應植物相關環境的能力，因此具有對植物寄生性線蟲進行生物防治的潛能。本研究以油菜為研究對象，研究HYS菌株是否影響油菜的發芽、生長，為利用HYS菌株進行植物的生物防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用試劑購自武漢迪躍創新生物科技有限公司，假單胞菌HYS菌株由武漢大學微生物學系保存，華油雜62油菜種子由華中農業大學油菜工程中心惠贈。

1.2 HYS菌株上清液

將HYS菌液按1∶100（V/V）加入LB培養液，在30 ℃、220 r/min的條件下培養14 h，菌液內HYS菌的濃度約為5.0×109 CFU/mL；菌液在4 ℃、12 000 r/min離心5 min，上清液用0.22 μm濾膜過濾除菌。

1.3 假單胞菌HYS菌株浸種對油菜種子發芽的影響

按水（CK）浸種、LB浸種、菌液浸種分組，每組3個重復；用培養皿濾紙法[10]進行油菜種子的發芽試驗。具體過程如下：選擇0.005 g且子粒飽滿的油菜種子[11，12]，每20粒種子放入1.5 mL離心管，標記離心管，分別加入300 μL水、LB或菌液浸種12 h，去除浸種液，用蒸餾水沖洗3遍。取直徑9 cm培養皿，內墊4層濾紙，加4 mL滅菌水，按標記播20粒種子，再從培養皿邊緣加1 mL水。室內空調設置27 ℃發芽，每天補充相同體積的水，記錄露白數和發芽數，104 h后測定芽高和根長。

1.4 假單胞菌HYS菌株對油菜種子發芽的影響

按水（CK）、LB和HYS菌液分組，每組3個重復。每培養皿播20粒種子，并在培養皿內均勻加入1 mL水、LB或HYS菌液，之后每天早上分別在各組加入1 mL水、LB或HYS菌液，補充相同體積的水。記錄露白數和發芽數，104 h后測定芽高和根長。

1.5 不同時間感染HYS菌株對油菜種子發芽的影響

按照加菌液的時間分為10組，分別為對照（CK，加水）、第四天加菌液（B1）、第三天加菌液（B2）、第二天加菌液（B3）、第一天加菌液（B4）、頭1～4 d加菌液（B5）、頭1～3 d加菌液（B6）、頭1～2 d加菌液（B7）、2～4 d加菌液（B8）和3～4 d加菌液（B9）組，除加菌液時間外，其余時間加水，每組3個重復。每培養皿播20粒種子，在培養皿內均勻加入1 mL水或菌液，之后每天試驗組分別在各組中加入1 mL水或菌液，水較少時補充相同體積的水。記錄露白數和發芽數，104 h后測定芽高和根長。

1.6 菌液上清對油菜種子發芽的影響

在上述油菜種子發芽過程中，發現用含HYS的菌液處理影響油菜種子發芽，菌液含HYS、LB和HYS分泌物，為區分這3種成分對油菜種子發芽的作用，設計試驗檢測HYS分泌物的作用效果。用LB培養HYS菌株，12 000 r/min離心，上清液過濾除菌，用水按10、100、1 000和10 000倍稀釋LB和上清液，每個處理3個重復。每培養皿播20粒種子，在培養皿內均勻加入1 mL水（CK）、LB、上清液、倍比稀釋的LB和上清液，之后每天在各組加入1 mL相同液體，補充相同體積的水。記錄露白數和發芽數，104 h后測定芽高和根長。

1.7 性狀測定

在發芽8 h后每2 h記錄每個培養皿的露白數， 油菜種皮裂開露出白色內容物即判定為露白。待發芽后每4 h記錄每個培養皿的發芽數，油菜兩片子葉展開即判定為發芽。

1.8 數據處理

所有數據用Excel 2007、SAS 8.1軟件進行分析，差異顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 假單胞菌HYS菌液浸種對油菜種子發芽的影響

2.1.1 假單胞菌HYS菌液浸種對油菜種子露白的影響 從表1可以看出，水、LB和HYS菌液浸種處理組最后的露白數沒有差異，但發芽16 h和20 h時，水、LB浸種組露白數顯著高于HYS菌液浸種組，說明HYS菌液浸種不影響油菜種子最后的露白數，但HYS菌株產生的某種物質會在發芽過程的特定時期顯著抑制油菜種子的露白，即浸種液中的HYS菌株顯著抑制油菜種子的露白進程。

2.1.2 假單胞菌HYS菌液浸種對油菜種子發芽的影響 從表2可以看出，水、LB和HYS菌液浸種處理組最后的發芽數沒有顯著差異，但在發芽88 h時，HYS菌液浸種組的發芽數顯著低于水、LB浸種組，說明HYS菌液浸種不影響油菜種子最終的發芽數，但在發芽過程的特定時期顯著抑制油菜種子的發芽，即浸種液中的HYS菌株顯著抑制油菜種子的發芽進程。

2.1.3 假單胞菌HYS菌液浸種對油菜幼苗生長的影響 水、LB和HYS菌液浸種組的油菜芽高和根長沒有顯著差異，說明浸種液中的HYS菌株不影響油菜種子發芽的芽高和根長。

2.2 假單胞菌HYS菌株對油菜種子發芽的影響

2.2.1 假單胞菌HYS菌株對油菜種子露白的影響 從表3可以看出，水、LB和HYS菌液處理組最后的露白數都沒有差異，但在發芽12～16 h，LB處理組露白數較水處理組顯著降低，在發芽12～18 h，HYS菌液組露白數顯著低于水處理組，說明LB和假單胞菌HYS菌株會在油菜種子發芽的特定時期抑制油菜種子的露白。在發芽16 h時，水處理組露白數最高，顯著高于LB處理組，而LB處理組的露白數又顯著高于HYS菌液組，說明在油菜種子發芽的特定時期，含假單胞菌HYS菌株的菌液抑制油菜種子的露白，且這種抑制作用不完全是LB的作用造成的，假單胞菌HYS菌株也發揮了重要作用，即假單胞菌HYS菌株顯著抑制油菜種子的露白進程。

2.2.2 假單胞菌HYS菌株對油菜種子發芽的影響 從圖1可以看出，在整個發芽期間，水處理組發芽數顯著高于LB和HYS菌液處理組，說明LB抑制油菜種子的發芽。在油菜種子發芽80 h時，水處理組發芽數最高，顯著高于LB處理組，而LB處理組的發芽數又顯著高于HYS菌液組，說明在油菜種子發芽的特定時期，含HYS菌株的菌液抑制油菜種子的發芽，且這種抑制作用不完全是LB的作用造成的，HYS菌株也發揮了重要作用。這些結果說明HYS菌株抑制油菜種子的發芽，且這種抑制作用可能是HYS菌株增殖過程中產生的某種物質發揮了重要作用。

2.2.3 假單胞菌HYS菌株對油菜幼苗生長的影響 從圖2可以看出，油菜發芽后的芽高由高到低依次為水處理組、LB處理組和HYS菌液組，說明HYS菌液抑制油菜芽的生長，且這種抑制作用不完全是LB造成的，HYS菌株在此過程中發揮了重要的抑制作用。水處理組的根長顯著高于LB處理組和HYS菌液組，且后兩組的根長差異不明顯，說明LB抑制油菜根的生長，假單胞菌HYS菌株可能對油菜的根沒有明顯作用。

2.3 不同時間感染假單胞菌HYS菌株對油菜發芽的影響

由于HYS菌株抑制油菜種子的露白進程，也抑制油菜種子的發芽和幼苗生長，因此以水處理為對照，在油菜種子發芽過程的不同時期感染假單胞菌HYS菌株，觀察HYS菌株對油菜種子發芽的影響，希望能找出HYS菌株最易影響油菜種子發芽的時間點。在本研究發芽環境溫度條件下，油菜種子露白只需24 h，因此，本部分試驗的水處理組與HYS菌液處理組油菜種子露白結果與“2.2”節假單胞菌HYS菌液對油菜種子發芽的影響相同，故此處不再比較HYS菌液組與對照組的露白數。

2.3.1 不同時間感染假單胞菌HYS菌株對油菜種子發芽的影響 不同時間感染HYS菌株的油菜種子發芽數見表4。從表4可以看出，如果在整個發芽的4 d時間內僅1 d時間感染假單胞菌HYS菌株，則在發芽的88～96 h期間，各處理組的發芽數沒有顯著差異，但第二天加菌液組發芽數有降低的趨勢，第一天加菌液組發芽數則更低。在發芽80 h時，水處理組、第四天加菌液組和第三天加菌液組發芽數沒有差異，而這3組發芽數顯著高于第二天加菌液組，第二天加菌液組的發芽數又顯著高于第一天加菌液組，這說明在油菜種子的發芽過程中，頭1～2 d感染HYS菌株都會顯著抑制油菜種子的發芽，而且感染時間越早對油菜種子發芽的抑制效果越強。

如果在整個發芽的4 d時間內連續數天感染假單胞菌HYS菌株，則油菜種子發芽數由低到高依次為頭1～4 d加菌液組、頭1～3 d加菌液組、頭1～2 d加菌液組、2～4 d加菌液組、3～4 d加菌液組，且在發芽80 h時，除頭1～3 d加菌液組和頭1～2 d加菌液組間外，其他組連續感染HYS菌株的油菜種子發芽數的差異都達顯著水平，但2～4 d加菌液組和3～4 d加菌液組最終的發芽數與水處理組沒有明顯差異，這也說明第一天感染HYS菌株對油菜種子發芽的抑制作用最強。在發芽的80～96 h，頭1～2 d加菌液組、頭1～3 d加菌液組和頭1～4 d加菌液組的發芽數都顯著低于僅第一天加菌液組，說明連續感染HYS菌株對油菜種子發芽的抑制作用更強。

2.3.2 不同時間感染假單胞菌HYS菌株對油菜幼苗生長的影響 從表5可以看出，全部加HYS菌組的油菜根長都顯著短于水處理對照組，這進一步說明LB抑制油菜根的生長。從B1組到B4組的根長數據可以看出，如果在整個發芽的4 d時間內僅1 d時間接觸LB，則油菜根長由長到短依次為水處理組、第四天加菌液組、第三天加菌液組、第二天和第一天加菌液組，且各組間差異顯著，說明LB抑制油菜根的生長，且在油菜發芽的早期這種抑制作用更強。從B5組到B9組的根長數據可以看出，如果在整個發芽的4 d時間內連續數天添加假胞菌HYS菌液，則油菜根長比僅1 d添加菌液組更短，說明油菜連續接觸LB更不利于油菜根的生長，且連續接觸LB的時間越長對油菜根生長的抑制作用越強。

從B0到B4組的芽高數據可以看出，第一天加菌液組與水處理對照組的芽高相同，但第二天加菌液組、第三天加菌液組、第四天加菌液組和3～4 d加菌液組芽高顯著高于水處理對照組，說明僅1 d接觸HYS菌株不會影響油菜芽的生長，相反，由于菌液含LB，LB的營養物質可能還可促進油菜芽的生長。從B5到B8的芽高數據可以看出，頭1～4 d加菌液組、頭1～2 d加菌液組、頭1～3 d加菌液組的芽高都顯著低于水處理對照組，說明連續添加假單胞菌HYS菌株抑制油菜芽的生長，且這種抑制作用主要在發芽的頭1～3 d發揮作用。

2.4 假單胞菌HYS菌液上清液對油菜發芽的影響

2.4.1 假單胞菌HYS菌液上清液100倍稀釋液對油菜發芽的影響 由表6可知，試驗開始后12～18 h時，上清液100倍稀釋組露白數與水處理組間無顯著差異，兩者都顯著高于LB 100倍稀釋液處理組，20 h時，3組處理的露白數沒有顯著差異，說明HYS菌液上清液經100倍稀釋處理不影響油菜種子的露白，但LB經100倍稀釋后卻抑制油菜種子的露白進程。

由表7可知，發芽64～82 h，上清液100倍稀釋組的發芽數高于水處理組，在發芽72 h，上清液100倍稀釋液組的發芽數顯著高于LB 100倍稀釋液組，后者的發芽數又顯著高于水處理組，在發芽的86 h之后，3組的發芽數沒有顯著差異，說明HYS菌株的上清液經100倍稀釋可促進油菜種子的發芽進程。

經100倍稀釋處理的LB組和上清液組芽苗長度大于水處理組，說明100倍稀釋的LB有助于油菜苗生長。

2.4.2 假單胞菌HYS菌液上清液1 000倍稀釋液對油菜發芽的影響 由表8可以看出，12～16 h時，上清液1 000倍稀釋液組露白數與水處理組差異不顯著，兩組露白數顯著高于LB 1 000倍稀釋液組；16 h后，3組的露白數沒有差異，這說明HYS菌液上清液經1 000倍稀釋處理不影響油菜種子的露白，但稀釋1 000倍的LB卻抑制油菜種子的露白進程。

由表9可以看出，在發芽60～72 h，上清液1 000倍稀釋液組發芽數高于LB 1 000倍稀釋液組，后者發芽數又高于水處理組，72 h后各處理組發芽數沒有顯著差異，這說明HYS的上清液經1 000倍稀釋可促進油菜種子的發芽進程。

3 討論

3.1 假單胞菌HYS菌株浸種對油菜種子發芽的影響

浸種指用清水或各種溶液浸泡植物種子，可以促進種子早發芽，若使用化學藥劑或生物菌劑還可抑制或殺死種子的有害寄生菌，從而達到生物防治的目的。種子的萌發是一個從吸水膨脹到萌動，再到發芽的呼吸代謝過程[13]。本研究發現油菜種子浸種后有明顯的吸脹現象，所以用HYS菌株對油菜種子進行浸種處理，則水分和菌株代謝產物可能透過種皮作用于油菜種子而影響其發芽。本研究結果表明HYS菌株浸種不影響油菜種子最后的露白和發芽，也不影響油菜的芽和根的生長，但顯著抑制油菜種子的露白和發芽進程。說明HYS菌株的代謝產物可能通過浸種方式透過種皮，從而影響油菜種子的露白和發芽進程。

3.2 假單胞菌HYS菌株對油菜種子發芽的影響

假單胞菌廣泛存在于土壤、水、動植物和人體內，在農業領域內，有的假單胞菌是植物病原菌[14]，有的則有益于植物生長[15]，也有的通過拮抗或殺死病原菌發揮對植物疾病進行生物防治的作用[16]。本試驗用LB培養HYS菌株，在油菜發芽過程中添加菌液，發現菌液嚴重抑制油菜根的生長，且這種抑制作用是由LB引起的。

本試驗在油菜種子發芽過程中用HYS菌株連續處理，發現油菜種子最后都會全部露白，但HYS菌株顯著抑制油菜種子的露白進程，也顯著抑制油菜種子的發芽和發芽后的芽高，說明油菜種子在發芽過程中可能受HYS菌株代謝產物的影響，且其對發芽的影響作用比用HYS菌株浸種處理的效果更明顯。

本試驗在油菜種子發芽過程中，在不同時間點用HYS菌株進行處理，發現在發芽的頭1～2 d用HYS菌株處理則顯著抑制油菜種子的露白和發芽，而且處理時間越早，對油菜種子發芽的抑制效果越嚴重，若連續用HYS菌株處理則抑制效果還要更強。若在發芽過程中只在某一天接觸HYS菌株，則HYS菌株不影響油菜芽的生長，但2 d及以上接觸HYS菌株，則會影響油菜芽的生長，而且處理時間越早越容易抑制油菜芽的生長。

這些結果說明油菜種子在發芽過程中如直接接觸HYS菌株，則HYS菌株直接或通過其代謝產物抑制油菜種子的露白進程，但若僅接觸1 d，則不影響油菜芽的生長。HYS菌株也抑制油菜種子的發芽、發芽后的芽高，且接觸時間越早或接觸的時間越長，對油菜芽生長的抑制作用越強烈。

3.3 假單胞菌HYS菌液上清稀釋液對油菜種子發芽的影響

在油菜種子發芽過程中，發現用含HYS的菌液處理影響油菜種子發芽，菌液含HYS菌株、LB和HYS分泌物，且LB嚴重影響油菜根的生長，推測LB的滲透壓太大灼傷油菜根，但LB的營養應該可以為油菜生長提供營養，故分離HYS上清液，上清液內含LB和HYS分泌的成分，為了排除LB對油菜發芽的影響，采用相同倍比稀釋的LB為對照，即將LB和上清液稀釋10～10 000倍，進而獲得HYS分泌物對油菜發芽的直接作用。結果表明，在排除LB灼傷油菜根和為油菜發芽提供營養的作用后，100倍和1 000倍稀釋上清液不影響油菜種子的露白，且促進油菜種子的發芽進程，說明上清液內HYS的分泌物能促進油菜種子的發芽進程。

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