超聲—乙醇法提取血紅鉚釘菇子實體總黃酮工藝研究

趙聰+陳貴堂+王海翔+楊志萍+程抒劼+綦國紅

摘要：通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化了超聲-乙醇法提取血紅鉚釘菇（Chroogomphus rutilus）子實體中總黃酮的工藝。結果表明，血紅鉚釘菇中總黃酮最佳提取條件為70%乙醇，料液比1∶30（m/V），超聲時間30 min，最佳工藝條件下總黃酮提取率為5.91%。

關鍵詞：血紅鉚釘菇（Chroogomphus rutilus）；超聲；總黃酮；提取

中圖分類號：TQ463+.24；R284.2；S646.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）07-1309-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.07.028

Extraction Process of Total Flavonoid from Chroogomphus rutilus

by Ultrasonic Wave-Ethanol

ZHAO Cong， CHEN Gui-tang， WANG Hai-xiang， YANG Zhi-ping， CHENG Shu-jie， QI Guo-hong

（School of Engineering， China Pharmaceutical University， Nanjing 211198，China）

Abstract： The extraction process of total flavonoid from Chroogomphus rutilus fruit bodies was optimized by single factor and orthogonal experiments using ultrasonic wave-ethanol. With rutin as reference substance，the total flavonoid content was determined using aluminum nitrate colorimetric method. The optimal extraction conditions was ethanol concentration 70%，solid-liquid ratio 1∶30（m/V） and the ultrasonic time 30 min. The extraction yield of total flavonoid was up to 5.91% under the optimum conditions.

Key words： Chroogomphus rutilus； ultrasonic wave； total flavonoid； extraction

血紅鉚釘菇（Chroogomphus rutilus）為菌根性食用菌，即生于土壤并與樹木形成外生菌根的食用菌[1]。屬于擔子菌亞門傘菌目鉚釘菇科鉚釘菇屬[2]，主要生長于北溫帶[3]。東北地區(qū)俗稱紅蘑、松樹傘、松蘑等[4]。子實體散生、群生或單生[5]，人工培養(yǎng)較為困難[1]。血紅鉚釘菇肉質鮮美，營養(yǎng)價值高，富含蛋白質、糖類、酚類及黃酮類化合物，具有抗腫瘤[6]、抗氧化[7]、神經元保護[8]等多種藥理活性，深受人們的喜愛。近年來對血紅鉚釘菇的研究多集中在多糖和蛋白質成分方面，而對其次生代謝產物黃酮類化合物研究鮮見報道。黃酮類化合物廣泛存在于蔬菜水果中，各種體內體外試驗表明黃酮具有多種生物學活性，如抗氧化[9，10]、抗腫瘤[11-13]、抗炎[14]和雌激素樣作用等[15，16]。黃酮提取是其功能研究的第一步，但目前未見血紅鉚釘菇中總黃酮提取工藝的研究報道。

總黃酮的提取一般采用醇提法，但此方法耗時長且提取率不高[17]。本試驗采用超聲-乙醇提取法，以總黃酮提取率作為指標，探究血紅鉚釘菇中總黃酮最佳提取工藝，以期對該食用菌中總黃酮的研究與應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

血紅鉚釘菇購于遼寧朝陽，洗凈烘干后用中藥粉碎機粉碎，過60目篩。蘆丁標準品，購于上海金穗生物科技有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

DFY-500型搖擺式高速中藥粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司；Tu-1990/Tu-1991型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；LXJ-ⅡB型低速大容量多管離心機，上海安亭科學儀器廠；GZX-9070 MBE型電熱鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；FA-N/JA-N型系列電子天平，上海民橋精密科學儀器有限公司；JY92-ⅡN型超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的制作 將蘆丁標準品120 ℃烘干至恒重，準確稱取10 mg，用70%乙醇等比例稀釋成濃度為0～100 μg/mL的混合溶液。分別取1 mL各濃度下的蘆丁溶液，先后加入1 mL 70%乙醇溶液和0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻后靜置6 min，再加入0.3 mL 10%的硝酸鋁溶液，搖勻后靜置6 min，最后再加入4%的氫氧化鈉溶液2 mL，搖勻，靜置10 min。用70%乙醇溶液作空白對照，在波長510 nm處測定吸光度。以濃度為橫坐標（x），吸光度為縱坐標（y）繪制標準曲線。線性回歸方程為y=0.002 5x-0.004 8，R2=0.998 9。

1.3.2 血紅鉚釘菇中總黃酮含量的測定 稱取血紅鉚釘菇粉1 g，按一定的料液比加入一定體積分數(shù)的乙醇溶液，攪拌均勻后靜置30 min。冰浴條件下，超聲處理一段時間，4 000 r/min離心10 min，取上清液，定容至100 mL。取1 mL溶液定容至10 mL，按“1.3.1”中的方法進行測定。根據(jù)公式計算總黃酮提取率?？傸S酮提取率=總黃酮含量（g）/血紅鉚釘菇干粉質量（g）×100%。

1.3.3 總黃酮提取率單因素試驗與正交試驗 對影響超聲波提取血紅鉚釘菇中總黃酮的超聲時間、料液比、乙醇體積分數(shù)進行單因素試驗和正交試驗，確定最佳提取工藝。正交試驗因素和水平見表1。

2 結果與分析

2.1 超聲時間對血紅鉚釘菇總黃酮提取率的影響

在料液比為1∶30（m/V，下同），乙醇體積分數(shù)為50%，超聲功率為200 W的條件下，分別以超聲時間10、20、30、40、50 min對血紅鉚釘菇進行處理，結果如圖1所示。由圖1可知，超聲時間在30 min時總黃酮提取率最高。超聲處理有利于細胞破壁，超聲處理時間低于30 min時，超聲時間越長，提取率越高。但隨著超聲時間的延長，體系溫度升高，導致總黃酮分解或氧化，而且隨著超聲處理時間的延長，溶劑揮發(fā)量增加，不利于總黃酮提取，所以超聲處理超過30 min后提取率下降。而且，隨著超聲時間的增加，其他醇溶性雜質的溶出量隨之增加，對總黃酮測定造成干擾，這也是50 min處理時提取率高于 40 min的原因。

2.2 料液比對血紅鉚釘菇總黃酮提取率的影響

在超聲處理時間為30 min，乙醇體積分數(shù)為50%，超聲功率為200 W的條件下，料液比分別為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50進行提取，結果見圖2。由圖2可知，料液比為1∶20時血紅鉚釘菇總黃酮提取率最高，之后隨著溶劑量增加，提取率反而下降，可能是隨著溶劑用量增加其他醇溶性雜質溶出率也隨之增加，影響總黃酮的提取，從而使總黃酮提取率降低。

2.3 乙醇體積分數(shù)對血紅鉚釘菇總黃酮提取率的影響

在超聲時間為30 min，料液比為1∶20，超聲功率為200 W的條件下，不同乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取率的影響如圖3所示。由圖3可知，乙醇體積分數(shù)為70%時，總黃酮提取率最高。黃酮類化合物為脂溶性物質，增加乙醇體積分數(shù)總黃酮溶解度隨之增加，從而使提取率增加。但隨著乙醇體積分數(shù)的增加，溶劑揮發(fā)量增加，而且其他醇溶性雜質的溶出也會增加，從而導致提取率下降。

2.4 正交試驗結果

根據(jù)單因素試驗結果，進行L9（34）正交試驗，結果見表2。根據(jù)極差分析可以得出，各因素對血紅鉚釘菇總黃酮提取效果的影響主次順序為C>B>A，即乙醇體積分數(shù)>料液比>超聲時間。由正交試驗結果可知，總黃酮最佳提取條件為乙醇體積分數(shù)70%，料液比1∶30，超聲提取時間30 min。

2.5 驗證試驗

按照正交試驗所得最佳提取條件進行驗證試驗，得到血紅鉚釘菇總黃銅平均提取率為5.91%。試驗表明，最佳提取工藝是可行的。

3 小結

通過單因素試驗和正交試驗，確定了超聲-乙醇法提取血紅鉚釘菇子實體中總黃酮的最佳工藝條件為乙醇體積分數(shù)70%，料液比1∶30，超聲時間30 min。最佳工藝條件下，總黃酮提取率為5.91%。

參考文獻：

[1] 欒慶書.血紅鉚釘菇研究現(xiàn)狀及開發(fā)利用[J].食用菌，2002（2）：2-3.

[2] 李貞卓，包海鷹.血紅鉚釘菇化學成分和藥理活性研究概述[J]. 菌物研究，2015，13（3）：181-186.

[3] 陳添興.南京紫金山大型菌物多樣性研究[D].南京：南京師范大學，2012.

[4] 戴玉成，圖力古爾.中國東北野生食藥用真菌圖志[M].北京：科學出版社，2007.

[5] 李 華，衛(wèi) 敏，薛龍龍，等.血紅鉚釘菇子實體中化學成分類型及多糖含量[J].食用菌學報，2011，18（4）：67-68.

[6] 唐 超，王清吉，葛 蔚，等.血紅鉚釘菇多糖對小鼠S180肉瘤的抑制作用[J].安徽農業(yè)科學，2010，38（6）：2966-2967.

[7] GAO C J，WANG Y H，WANG C Y，et al. Antioxidant and immunological activity in vitro of polysaccharides from Gomphidius rutilus mycelium[J].Carbohydrate Polymers，2013，92（2）：2187-2192.

[8] 張雪倩，孫 紅，王立安，等.色釘菇粗多糖對小鼠DA能神經元MPTP損傷的保護作用[J].菌物學報，2011，30（1）：77-84.

[9] 周曉麗，邵 震，李婷婷，等.木瓜黃酮的提取及抗氧化性研究[J].食品工業(yè)科技，2007，28（8）：170-172.

[10] 方玉梅，譚 萍，王毅紅，等.金針菇黃酮類化合物清除DPPH自由基活性[J].食品研究與開發(fā)，2012，33（7）：8-10.

[11] 崔譽蓉，李德芳，鞠 寶，等.四種甘草黃酮類化合物體外抗腫瘤作用研究[J].食品科技，2010，35（7）：88-92.

[12] 張明發(fā)，沈雅琴.甘草粗提物及其黃酮類成分的抗腫瘤作用[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2010，25（2）：124-129.

[13] 向明鈞，周衛(wèi)華，彭 霞，等.茶樹花黃酮類物質抗腫瘤作用研究[J].食品工業(yè)科技，2013，34（12）：157-160.

[14] SINGH M，KAUR M，SILAKARI O. Flavones：An important scaffold for medicinal chemistry[J].European Journal of Medicinal Chemistry，2014，84：206-239.

[15] 汪遠金，許金林，張 杰，等.大豆異黃酮對去卵巢大鼠骨質疏松癥的實驗研究[J].食品科學，2003，24（2）：120-122.

[16] 朱瑞清，葛寶豐，陳克明，等.金雀異黃酮與芹菜素的雌激素樣作用體外研究[J].中國中藥雜志，2012，37（15）：2318-2332.

[17] 王毓寧，陳和平，馮作山.超聲波-乙醇法提取蘆蒿總黃酮的工藝研究[J].江蘇農業(yè)科學，2007（5）：215-217.