微囊藻受短時超聲波脅迫蛋白表達差異研究

駱靈喜+李彬輝+林秋月+王波

摘要：為探索微囊藻抵抗短時超聲波表達調控相關蛋白質，應用雙向電泳技術對微囊藻短時超聲波處理蛋白質表達進行分析，結果表明，71個蛋白質點上調，56個蛋白質點下調，54個新增蛋白質點，21個消失蛋白質點。對其中8個差異大的蛋白質點采用MALDA-TOF-MS進行質譜分析，并經數據庫搜索匹配，鑒定出2個未知蛋白、6個功能蛋白。這些功能蛋白參與抗氧化和抗炎癥、磷酸鹽合成、電子傳遞等生理過程，實現微囊藻在短時超聲波脅迫下的代謝平衡和自我保護。

關鍵詞：微囊藻；短時超聲波；蛋白表達；雙向電泳

中圖分類號：X703 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）07-1366-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.07.043

Differentially Expressed Proteome of Microcystis under Short-time Ultrasound Stress

LUO Ling-xi1，2，LI Bin-hui1，2，LIN Qiu-yue1，2，WANG Bo1

（1.Peking University Shenzhen Research Institute，Shenzhen 510008， China；2.Shenzhen-Hongkong Institution of Industry，Education & Research Environmental Engineering Technique Co.，Ltd.，Shenzhen 510008， China）

Abstract：In order to explore the regulation mechanism for key protein expression， the Microcystis treated by short-time ultrasound were used to analyze the total protein based on 2DE. Results showed that 71 upregulated protein spots，56 downregulated protein spots，54 new adding protein spots and 21 protein spots disappeared under short-time ultrasound stress. Eight differential proteins were chosen for further MALDI-TOFTOF/MS analysis， the results showed that 2 unknown proteins and 6 functional proteins were detected. These proteins were relevant to some physiology procedures，such as antioxidant，anti-inflammatory，synthesis of phosphate and electron transfer，which were beneficial for the metabolism balance and self-protection under short-time ultrasound stress.

Key words：microcystis；short-time ultrasound；protein-expression；two-dimensional electrophoresis

近年來，隨著水體富營養化現象的日趨嚴重，對于飲用水源較為單一且緊缺的城市飲用水生產影響很大，首先，高藻源水會堵塞濾池，增加反沖洗次數和藥耗；其次會縮短管網的使用年限，增加配水動力費用；更重要的是，一些產毒素水華藻類（如微囊藻）會釋放出藻毒素，長期攝入容易引發肝癌、腸癌等疾病，嚴重威脅人體的健康[1，2]。盡管目前已經開發出多種治理藍藻水華的措施，包括物理打撈、噴灑化學除藻劑、黏土絮凝以及生物操縱等，但是這些除藻方法在經濟性、安全性和高效性等方面仍存在局限性，甚至會造成二次污染。而超聲波除藻由于其操作簡便、能耗低、無二次污染等特點被認為是極具潛力的治藻技術，同時也是近年來的研究熱點[3，4]。

目前國內外的研究均證明，超聲波處理方法可以有效抑制藻類繁殖，且與其他除藻方法有機結合能夠達到更理想的抑藻效果[5-8]。特別對于具有偽空泡的藍藻，超聲波處理對其的抑制作用更為明顯。研究顯示在超聲波輻射后，微囊藻的沉降率明顯高于其他藻類[9]，研究普遍認為由于微囊藻內部存在大量氣囊，受到超聲波的空化效應作用，內部氣囊產生巨大壓力而破裂，導致其失去浮力調節功能，最終下沉[10]。然而超聲波對微囊藻的抑制作用不僅僅體現在簡單的物理沉降作用，更是一個復雜而緩慢的生理生化作用過程。近年來，關于超聲波對銅綠微囊藻細胞生理生化特性影響的研究報道較少，僅有的研究認為超聲波能夠有效破壞藻細胞吸收光能的天線復合物和葉綠素，減慢光合作用，從而抑制細胞生長[11]，并且誘導藻細胞發生脂膜過氧化反應，增加膜透性[9]。但是針對微囊藻抵御短時超聲波脅迫的分子生物學應激反應機理的研究鮮見報道，在分子水平研究短時超聲波對微囊藻蛋白質表達的影響機理了解甚少，一定程度上減緩了超聲波除藻技術的發展。因此，本試驗以長時間超聲波對藻類聚集性和沉降性的作用機理作為參考，在此基礎上，進一步將短時超聲波作為藻類的脅迫因素，從分子生物學水平研究其引起的微囊藻蛋白質表達量和種類的差異，為確定短時超聲波強化混凝除藻技術的作用機理提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養

試驗選用的銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）是中國富營養化湖庫最常見的水華藍藻之一。藻種購于中國科學院水生生物研究所，編號FACHB-905，為產毒種類。培養溫度27±1 ℃，光暗比12 L∶12 D，光照度36 μE/（m2·s），培養時間7 d，培養基為高壓滅菌的BG-11培養基[12]。

1.2 試驗裝置

主要設備：JY92-IIN型超聲細胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；IPGhor型等電聚焦儀、DALT-SIX SDS-PAGE型電泳儀、ImageScanner掃描儀（GE Healthcare）。

其他設備：GZP-250型光照培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）；LDZ-50KB型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械有限公司）；TG16-WS型高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 短時超聲波處理 采用BG-11培養基將菌種樣品稀釋到適當濃度，然后將超聲波探頭放入菌液中，進行80 kHz、60 W超聲波處理5 s。

1.2.2 蛋白提取及測定 取適量菌樣，加入1 mL蛋白質裂解液（PL039），進行超聲波破碎（100 W，2 s，3 min），離心（4 ℃，12 000 r/min，30 min）去除沉淀，加1 mL預冷丙酮（-20 ℃沉淀過夜），離心（4 ℃，12 000 r/min，30 min）去除上清液，晾干沉淀，加入500 μL蛋白質裂解液（PL039），最后使用非干擾型蛋白質濃度測定試劑盒（SK3071）進行定量測定。

1.2.3 雙向電泳

1）第一向等電聚焦電泳。主要參照Bio-Rad等電聚焦系統操作指南進行，取400 μg蛋白質樣品，加上樣液（9 mol/L尿素，4% CHAPS，2%IPG緩沖液，40 mmol/L DTT，40 mmol/L Trisbase）至終體積450 μL，放入標準型膠條槽中。將17 cm IPG膠條膠面朝下覆蓋在樣品上，室溫吸收1 h后，加2 mL礦物油覆蓋。20 ℃下水化14 h，以50 μA電流和20 ℃聚焦溫度進行等電聚焦電泳。

2）第二向SDS-PAGE電泳。等點聚焦結束后，膠條依次在平衡液Ⅰ（含6 mol/L尿素，2%SDS，0.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，30%甘油，0.25%溴酚藍，5%DTT）和平衡液Ⅱ（含6 mol/L尿素，2%SDS，0.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，30%甘油，0.25%溴酚藍，5.5%IAA）中各平衡15 min后進行電泳。電泳后銀染顯色。

1.2.4 圖像掃描和分析 通過ImageScanner掃描儀獲取電泳圖像，采用PDquest 8.0軟件進行分析。對圖像進行背景消減、斑點檢測、凝膠匹配，檢出的蛋白質點進行歸一化處理，相同位置的染色點進行豐度分析，通過軟件計算蛋白質含量變化比值，變化比值在2倍以上的蛋白質點視為表達差異點。

1.3 MALDI-TOF-MS質譜分析與數據檢索

制備好樣品送生工生物工程（上海）股份有限公司進行質譜檢測，檢測儀器為Bruker Autofle MALDT-TOF-MS質譜儀。數據檢索：質譜峰人工去除胰酶自切峰和角蛋白峰的污染后，將數據在網站http：//www.ncbi.nlm.nih.gov上進行搜索匹配。

2 結果及分析

2.1 蛋白質雙向電泳分析

采用雙向電泳技術對經過短時超聲波處理的微囊藻總蛋白質進行分離，獲得背景清晰且分離效果較好的2-DE圖譜（圖1、圖2）。經過軟件PDquest 8.0分析，短時超聲波處理的蛋白質雙向電泳凝膠圖譜和對照組的顯著蛋白質差異點有127個，其中56個蛋白質點下調，71個蛋白質點上調，另外有54個新增蛋白質點，21個消失蛋白質點。

2.2 差異表達蛋白質點的質譜鑒定

選取其中豐度大于2、分離效果清晰的26個差異蛋白質點進行質譜鑒定，鑒定成功的有8個，質譜鑒定結果見表1，其中有2個未知蛋白質和6個功能蛋白質。這些功能蛋白質參與抗氧化和抗炎癥、磷酸鹽合成、電子傳遞等多個生理過程，實現微囊藻在短時超聲波脅迫下的代謝平衡和自我保護。

3 討論

3.1 與抗氧化、抗炎癥相關的蛋白

藻青蛋白α亞基片段。藻青蛋白質是藍綠藻內的藍色素，在活的藻細胞內，藻青蛋白質是蛋白質存儲單位和抗氧化劑，防止細胞受到某些波長的傷害。有研究表明，藻青蛋白質有較強的抗氧化和抗炎癥特性，在多種炎癥動物模型內，藻青蛋白質可以減少或預防炎癥。當微囊藻受到超聲波脅迫時，藻青蛋白α亞基片段呈現出明顯的差異表達，通過其抗氧化和抗炎癥等特性，對微囊藻起到自我修復和保護的作用。

3.2 與光合作用相關的蛋白

1，5-二磷酸核酮糖合成酶亞基。1，5-二磷酸核酮糖是在光合作用中的卡爾文循環里起重要作用的一種五碳糖。植物體內的酶用1，5-二磷酸核酮糖作為底物來固定二氧化碳，生成六碳磷酸鹽，這種高度不穩定的中間產物最終分解為兩分子的甘油3磷酸。當微囊藻受到超聲波脅迫時，可能其光合作用受到影響，從而造成該合成酶亞基出現差異表達。

3.3 與電子傳遞相關的蛋白

光系統PSⅠ復合體蛋白亞基。PSⅠ是光合電子傳遞鏈的一部分，位于類囊體膜的間質部分。當受到超聲波脅迫時，光合電子的傳遞可能受到影響，從而引起該蛋白質的較大差異表達。

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