630～650nm可見光對小鼠創面愈合的影響研究

毛和水 江文政 王野平 仇旭光

630～650nm可見光對小鼠創面愈合的影響研究

毛和水 江文政 王野平 仇旭光

目的 研究630～650nm可見光對小鼠創面愈合的影響，探討其調控炎癥反應的機制。方法 40只C57BL/6雄性小鼠以脊柱為對稱軸，在背部中間兩側對稱性制作直徑8mm的圓形全層皮膚缺損模型。小鼠左側創面設為實驗側組，右側創面設為對照側組。制模完成后實驗側組創面立即用630～650nm紅光治療儀照射，對照側組創面用LED臺燈照射。觀察并比較兩組創面不同時點的創面愈合率；采用免疫組化方法檢測創面中性粒細胞（PMN）、巨噬細胞（Mφ）等炎性細胞的浸潤情況；采用ELISA法檢測創面TNF-α、IL-6的表達水平。 結果 制模后3、7、12d，實驗側組創面愈合率均高于對照側組（均P＜0.05）。制模后24h、3d，實驗側組創面PMN、Mφ浸潤均較對照側組減少（均P＜0.05）。制模后12、24h，3、7d，實驗側組創面IL-6、TNF-α表達水平均低于對照側組（均P＜0.05）。 結論 630～650nm可見光能適度減少小鼠創面炎性細胞的浸潤，抑制炎性因子分泌，在一定程度上降低炎癥反應強度，有效促進急性創面的愈合。

630～650nm 可見光 弱激光治療 創面愈合 炎癥反應

1967 年，Mester[1]在研究激光治療是否有致癌作用時意外發現低強度的紅寶石激光（波長690nm）不僅無致癌作用，反而能促進毛發生長。此后眾多學者對此進行深入研究，并提出弱激光治療（LLLT）的概念，即波長在紅光至近紅外光之間（600～1 000nm），功率密度為0.001～5.000W/cm2的光照射生物組織所致的生物學效應。LLLT過程中局部組織溫度不超過36.5℃或正常體溫，不會造成不可逆性損傷[2]，通過光調節細胞而發揮生物學效應。基于此，本實驗通過研究630～650nm可見光對小鼠創面愈合的影響，探討其調控炎癥反應的機制，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）實驗小鼠：清潔級C57BL/6雄性小鼠40只，體重18～22g，由南京大學模式動物研究所提供[動物許可證號：SYXK（蘇）2005-0004]。（2）主要藥物、試劑和儀器：S-P免疫組化試劑盒購自上海晶美生物技術有限公司。抗F4/80單克隆抗體、抗Myeloperoxidase單克隆抗體購自英國Abcam公司。檸檬酸緩沖液（pH 6.0）購自上海長島生物技術有限公司。IL-6酶聯免疫檢測試劑盒、TNF-α酶聯免疫檢測試劑盒均購自美國R&D公司。5810R Centrifuge高速低溫水平離心機購自德國Eppendorf公司。微量電動組織勻漿器購自美國KIMBLE公司。倒置熒光顯微鏡攝像系統購自日本Olympus公司。LED臺燈購自飛利浦照明投資有限公司，型號酷恩，功率3.6W。紅光治療儀購自深圳普門科技有限公司，型號c a r n a t i o n-6 6，波長（6 4 0±1 0）n m，輸出功率5 0 W。

1.2 方法

1.2.1 模型制備和實驗分組 3%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，麻醉滿意后，背部剃毛；用聚維酮碘消毒溶液消毒皮膚兩遍，以脊柱為對稱軸，在背部中間兩側對稱性制作直徑8mm的圓形全層皮膚缺損模型。制模完成后每只小鼠分籠飼養，創面每日拍照記錄及換藥1次。小鼠左側創面設為實驗側組，右側創面設為對照側組。制模完成后實驗側組創面立即用紅光治療儀照射，能量密度為5J/cm2，時間為200s，1次/d，照射過程中用錫紙遮蓋對照側組創面；對照側組創面用LED臺燈照射，能量密度為0J/cm2，時間為200s，1次/d，照射過程中用錫紙遮蓋實驗側組創面。制模后1、12、24h及3、7、12d各隨機選取4只小鼠，在距離創緣3mm的范圍內切取標本，一分為二，置于Eppondorf管中-80℃冰箱保存，其中1份采用ELISA法檢測TNF-α、IL-6的表達，另1份用10%甲醛溶液固定，采用免疫組化方法檢測組織中性粒細胞（PMN）、巨噬細胞（Mφ）等炎性細胞的浸潤情況。

1.2.2 創面愈合情況評估 肉眼觀察到創面完全被上皮組織覆蓋即為創面愈合。兩組創面均于制模后第3、7、12d應用Image-J分析數碼相機拍攝圖像，并按以下公式計算創面愈合率。創面愈合率=（初始創面面積-未愈合創面面積）/初始創面面積×100%。

1.2.3 PMN、Mφ檢測 標本常規制作石蠟包埋切片，切取厚度為5μm。經免疫組化染色，檢測創面組織中PMN、Mφ的浸潤情況。PMN免疫組化染色：一抗為兔源性MPO多克隆抗體，細胞質染色提示陽性。Mφ免疫組化染色：一抗為大鼠源性F4/80單克隆抗體，細胞質染色提示陽性。光鏡下觀察兩組創面的炎癥細胞浸潤情況；400倍顯微鏡下隨機選取6個視野行計算機圖像分析計數PMN、Mφ并取平均值。

1.2.4 TNF-α、IL-6檢測 采用ELISA法測定兩組創面不同時點TNF-α、IL-6蛋白的表達水平，操作按試劑盒說明書進行。預先包被的抗體為單克隆抗體，檢測相抗體為多克隆抗體，經生物素標記。組織勻漿，取上清液。樣品和生物素標記抗體先后加入酶標板孔反應后，PBS洗滌。隨后加入過氧化物酶標記的親和素反應；經過PBS的徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的TNFα、IL-6呈正相關，隨后用酶標儀在450nm測定吸光度值。通過繪制標準曲線求出創面組織TNF-α、IL-6蛋白表達水平。

1.3 統計學處理 應用SPSS 13.0統計軟件；計量資料以表示，兩組比較采用配對t檢驗。

2 結果

2.1 兩組創面各時點愈合情況比較 見圖1、表1。

圖1 兩組創面各時點愈合情況肉眼觀察比較

表1 兩組創面各時點愈合率比較（%）

由圖1可見，制模后3d開始，實驗側組創面較對照側組創面干燥，創面上皮化明顯加快。由表1可見，制模后3、7、12d，實驗側組創面愈合率均高于對照側組（均P＜0.05）。

2.2 兩組創面各時點PMN、Mφ浸潤情況比較

2.2.1 兩組創面各時點PMN浸潤情況比較 見圖2、表2。

由圖2可見，制模后24h，實驗側組創面PMN浸潤較對照側組減少。由表2可見，制模后1h，兩組創面PMN浸潤比較無統計學差異（P＞0.05）；制模后12h、24h、3d，實驗側組創面PMN浸潤均較對照側組減少（均P＜0.05）；制模后7、12d，兩組創面PMN浸潤比較均無統計學差異（均P＞0.05）。

2.2.2 兩組創面各時點Mφ浸潤情況比較 見圖3、表3。

由圖3可見，制模后7d，實驗側組創面Mφ浸潤較對照側組減少。由表3可見，制模后1、12h，兩組創面Mφ浸潤比較均無統計學差異（均P＞0.05）；制模后24h，3、7、12d，實驗側組創面Mφ浸潤均較對照側組減少（均P＜0.05）。

2.3 兩組創面各時點IL-6、TNF-α表達水平比較 見表4。

圖2 兩組創面制模后2 4 h P M N浸潤情況比較（a：實驗側組；b：對照側組；免疫組化染色，×4 0 0）

圖3 兩組創面制模后7 d M φ浸潤情況比較（a：實驗側組；b：對照側組；免疫組化染色，×4 0 0）

表2 兩組創面各時點P M N浸潤情況比較（個）

表3 兩組創面各時點M φ浸潤情況比較（個）

表4 兩組創面各時點I L-6、T N F-α表達水平比較

由表4可見，制模后1h，兩組創面IL-6、TNF-α表達水平比較均無統計學差異（均P＞0.05）；制模后12、24h，3、7d，實驗側組創面IL-6、TNF-α表達水平均低于對照側組（均P＜0.05）；制模后12d，兩組創面IL-6、TNF-α表達水平比較均無統計學差異（均P＞0.05）。

3 討論

正常的創面愈合是復雜而有序的生物學過程，炎癥反應從中扮演著重要角色。適度而有序的炎癥反應能夠有效促進愈合，不足或過激則會影響創面愈合[3]。目前LLLT主要應用于促進創面愈合及組織修復，緩解因急慢性疾病引起的炎癥、水腫、疼痛，以及治療其他神經系統疾病[4]。創面愈合是LLLT較早應用的領域之一。實驗研究證明，LLLT對創面愈合的各個環節均有作用[5]：它能促使炎性細胞向創面遷移，并增強其功能；能刺激上皮細胞、內皮細胞、角蛋白形成細胞、成纖維細胞等修復細胞增殖；促進膠原蛋白的合成和沉積，促進血管新生，促進組織重塑。

本實驗結果顯示，小鼠實驗側組創面在制模后3d愈合開始加速，傷后12d已全部愈合，而對照側組創面此時仍有部分未愈。這提示LLLT能有效促進急性創面愈合。本實驗觀察到，在整個創面愈合過程中，尤其是在炎癥早期，實驗側組創面PMN、Mφ浸潤均較對照側組減少；在各時點，實驗側組創面IL-6、TNF-α表達水平均低于對照側組。這表明LLLT在炎癥反應階段能適度減少創面PMN、Mφ的浸潤，進而降低炎癥反應強度。炎性細胞的的適時、適度浸潤，能夠啟動機體自我防御性保護機制，降解壞死組織和病原體，分泌某些細胞因子（如IL-6、TNF-α、生長因子等）。這些細胞因子既能促進炎性細胞的趨化、浸潤又能促進各類修復細胞增殖、分化，形成大量細胞外基質和毛細血管，促進上皮化。后期炎癥反應強度的下降避免了過度炎癥的不利影響，從而促進創面愈合。研究發現，LLLT通過調控NF-Kb信號通路，調節多種細胞因子、炎癥介質和生長因子的合成、分泌，如減少炎性細胞的浸潤，減少IL-6、TNF-α等炎性因子的分泌[6]；促進血管內皮生長因子、角質細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子等細胞/生長因子的生成和釋放[7]，而這些生長因子使得包括上皮細胞、內皮細胞、角化細胞、淋巴細胞、纖維細胞等細胞增殖并促進膠原蛋白的合成、血管新生、肉芽形成，從而加速創面愈合[8]。

綜上所述，本實驗研究表明630～650nm可見光能適度減少小鼠創面PMN、Mφ的浸潤，抑制IL-6、TNF-α等炎性因子分泌，在一定程度上降低炎癥反應強度，有效促進急性創面的愈合。

[1]Mester E.The effect of laser beams on the growth of hair in mice [J].RadiobiolRadiother,1968,9(5):621-626.

[2]Shirin Farivar,Talieh Malekshahabi,Reza Shiari,et al.Biological Effects of Low LevelLaser Therapy[J].J Lasers Med Sci,2014,5 (2):58-62.

[3]青春.皮膚局部炎癥反應與創面修復[J].創傷外科雜志,2009,11(5): 385-387.

[4]Chung H,Dai T,Sharma S K,et al.The nuts and bolts of low level laser(light)therapy[J].Ann Biomed Eng,2012,40(2):516-533.

[5]Amid R,Kadkhodazadeh M,Ahsaie M G,et al.Effect of low level laser therapy on proliferation and differentiation of the cells contributing in bone regeneration[J].J Laser MedSci,2014,5(4):163-170.

[6]Gupta A,KeshriG K,Yadav A,et al.Superpulsed(Ga-As,904 nm) low-level laser therapy(LLLT)attenuates inflammatory response andenhances healing of burn wounds[J].J Biophotonics,2015,8 (6):489-501.

[7]Kuffler D P.Photobiomodulation in promoting wound healing:a review[J].Regen Med,2016,11(1):107-122.

[8]毛和水,姚敏,方勇.弱激光療法在創面愈合中的作用研究進展[J].中華燒傷雜志2012,28(6):462-465.

630-650nm visiblelightpromotesacutewound healing in mice

MAO Heshui,JIANG Wenzheng,WANG Yeping,etal.

Department of Burn and Plastic Surgery,Jinhua Central Hospital,Jinhua 321000,China

Objective To investigate the effects of 630-650nm visible light on wound healing in mice. Methods The round full-thickness skin defects of 8mm diameter were symmetrically made in the back of 40 male C57BL/6 mice.The left side of the wound was exposed to 630-650nm visible lights immediately after modeling(study group)and the right side was treated with normal LED light(control group).The wound healing rate at different time points was observed and compared between two groups.The infiltrations of neutrophils(PMN)and macrophages(Mφ)were detected by immunohistochemical staining;and the expression of TNF-a and IL-6 was detected with ELISA. Results The wound healing rate at 3d,7d and 12d after modeling in study group was significantly higher than that in control group(P＜0.05).The infiltration of PMN and Mφ was lower in study group than that in control group at 24h and 3d after the modeling (P＜0.05).The protein expression of IL-6 and TNF-α was lower in study group than that in control group at 12h,24h,3d and 7d after the modeling(P＜0.05). Conclusion 630～650nm visible light can promote the healing of acute wounds in mice,which is associated with the decreased infiltration of inflammatory cells and inhibiting the secretion of inflammatory factors.

630～650nm Visible lightLLLT Wound healing Inflammatory response

2 0 1 7-0 1-1 8）

（本文編輯：李媚）

10.12056/j.issn.1006- 2785.2017.39.8.2017- 140

321000金華市中心醫院燒傷整形皮膚外科

仇旭光，E- m ail：qw xg@ sohu.com