淫羊藿苷轉化產物的制備及活性研究

南敏倫于 淼趙昱瑋司學玲呂 娜赫玉芳*

（1 吉林省中醫藥科學院，吉林 長春 130012；2 長春三德天晟科技有限公司，吉林 長春 130012；3 修正藥業長春高新制藥有限公司，吉林 長春130012；4 吉林農業大學，吉林 長春 130118）

淫羊藿苷轉化產物的制備及活性研究

南敏倫1于 淼2趙昱瑋1司學玲3呂 娜4赫玉芳1*

（1 吉林省中醫藥科學院，吉林 長春 130012；2 長春三德天晟科技有限公司，吉林 長春 130012；3 修正藥業長春高新制藥有限公司，吉林 長春130012；4 吉林農業大學，吉林 長春 130118）

目的 旨在分析淫羊藿苷及轉化產物抑制α-葡萄糖苷酶活性研究。方法 對淫羊藿苷進行酶水解、酸水解、酶水解與酸水解相結合的方式進行結構轉化，采用薄層色譜法、理化方法、核磁共振波譜法對轉化產物進行結構鑒定，分別得到淫羊藿次苷Ⅰ、淫羊藿次苷Ⅱ、水合淫羊藿素、環淫羊藿素及脫水淫羊藿素。采用pNPG法建立α-葡萄糖苷酶篩選模型，對淫羊藿苷及其產物進行α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選。結果 體外活性試驗果表明，脫水淫羊藿素、淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ體外活性較淫羊藿苷好，其中脫水淫羊藿素（IC50=0.102 mg/mL）的活性最好，與拜糖平（IC50=0.850 mg/mL）相比抑制活性更強。結論 淫羊藿苷轉化產物可作為繼續進行結構修飾的先導化合物，具有深入研究和開發的前景。

淫羊藿苷；轉化產物；α-葡萄糖苷酶；活性

α-葡萄糖苷酶主要分布于小腸的上皮絨毛膜刷狀上，對糖的分解及代謝具有十分重要作用。當α-葡萄糖苷酶的活性受到抑制后，食物中多糖、雙糖向單糖的轉化速率就降低，從而有效的延緩糖的吸收，改善糖耐量，有效的控制并降低血糖的作用，同時可以提高糖耐量，具有預防和治療糖尿病及并發癥的特點[1]。

淫羊藿（Epimedii Folium）為小檗科淫羊藿屬植物，又名三枝九葉草、仙靈脾等。性溫，味辛、甘，歸肝、腎經，用于治療風濕痹痛、筋骨痿軟、腎陽虛衰、陽痿遺精、麻木拘攣等癥[2-3]。淫羊藿苷是主要黃酮類成分，文獻報道淫羊藿苷具有降血糖活性，本文擬對淫羊藿苷進行酸水解、酶水解、酸水解與酶水解相結合的手段得到淫羊藿苷的轉化產物。通過體外活性研究獲得高活性的轉化產物，為深入研究和開發α-葡萄糖苷酶抑制劑提供依據，并且為進一步研究各個化合物的活性基團提供參考。

1 試驗材料

1.1 材料與試劑：淫羊藿苷，自制（純度＞95%）；蝸牛酶（sigma公司）；pNPG（Merck公司）；4-硝基苯酚（PNP）（sigma公司）；酵母來源α-葡萄糖苷酶（sigma公司）；拜糖平（拜耳醫藥保健有限公司生產）；C18 ODS（北京綠百草科技發展有限公司）；水為自制超純水；其他均為國產分析純。

1.2 儀器與設備：酶標儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）；BS124S型電子天平（賽多利斯有限公司）；高效液相色譜儀（日立公司）；熔點測定儀（Yanacomicrometer）；液質聯用測定儀（Angilent1100LC/MSD）。

2 試驗方法

2.1 化合物Ⅰ的制備：取淫羊藿苷0.1 g，用乙醇25 mL溶解，加入5%稀硫酸25 mL，50 ℃攪拌24 h，放至室溫，加入去離子水25 mL，攪拌，過濾，濾餅用去離子水洗至中性，干燥，得粗品；再用甲醇5 mL溶解，通過常壓ODS柱（4.0 cm×40 cm）進行分離，以乙腈-水（45∶55）為流動相進行洗脫，薄層檢測，合并相同組分，回收溶劑，析晶，過濾，得到化合物Ⅰ 68.5 mg，收率為87.3%。

2.2 化合物Ⅱ的制備：取淫羊藿苷0.1 g，用DMSO 1.0 mL溶解，加入醋酸-醋酸銨緩沖液（pH為6.0）100 mL，蝸牛酶0.2 g，37 ℃保溫反應，以TLC檢測反應終點，反應結束后，離心，沉淀反復用水洗脫，干燥，得粗品；再用甲醇5 mL溶解，通過常壓ODS柱（4.0 cm×40 cm）進行分離，以乙腈-水（45∶55）為流動相進行洗脫，薄層檢測，合并相同組分，回收溶劑，析晶，過濾，得到化合物Ⅱ58.6 mg，收率為77.1%。

2.3 化合物Ⅲ的制備：取淫羊藿苷0.1 g，加入25 mL 2 mol/L的鹽酸溶液，攪拌，緩慢升溫至80 ℃，反應1 h，反應結束后，冷卻至室溫，放置4～8 h，過濾，濾餅用去離子水洗至中性，干燥，得酸反應產物；將上述的酸反應產物加至醋酸-醋酸銨緩沖液（pH為6.0）100 mL中，加入蝸牛酶0.2 g，37 ℃保溫反應，以TLC檢測反應終點，反應結束后，離心，沉淀反復用水洗脫，干燥，得粗品；再用甲醇5 mL溶解，通過常壓ODS柱（4.0 cm×40 cm）進行分離，以乙腈-水（70∶30）為流動相進行洗脫，薄層檢測，合并相同組分，回收溶劑，析晶，過濾，得到化合物Ⅲ48.6 mg，收率為85.1%。

2.4 化合物Ⅳ的制備：取淫羊藿苷0.1 g，加入5 mol/L的硫酸溶液25 mL和80%冰醋酸溶液30 mL的混合溶液，攪拌，緩慢升溫至85 ℃，反應72 h，反應結束后，冷卻至室溫，先用10%碳酸氫鈉溶液調pH為6.0，接著用乙醚萃取3次，每次100 mL，合并乙醚液，利用無水硫酸鈉對溶劑進行脫水，回收溶劑，甲醇重結晶，得到化合物Ⅳ49.2 mg，收率為90.4%。

2.5 化合物Ⅴ的制備：取淫羊藿苷0.1 g，用乙醇25 mL溶解，加入5%稀硫酸25 mL，50 ℃攪拌24 h，放至室溫，加入去離子水25 mL，攪拌，過濾，濾餅用去離子水洗至中性，干燥，干燥物用DMSO 1.0 mL溶解，加入醋酸-醋酸銨緩沖液（pH為6.0）100 mL，蝸牛酶0.2 g，37 ℃保溫反應，以TLC檢測反應終點，反應結束后，離心，沉淀反復用水洗脫，干燥；將干燥物用甲醇5 mL溶解，通過常壓ODS柱（4.0 cm× 40 cm）進行分離，以乙腈-水（70∶30）為流動相進行洗脫，薄層檢測，合并相同組分，回收溶劑，析晶，過濾，得到化合物Ⅴ47.5 mg，收率為87.3%。

2.6 α-葡萄糖苷酶抑制劑活性測定

2.6.1 檢測方法：參考文獻[4]的測定方法，向96孔板中加入pH = 6.86的PB緩沖液30 μL，1.0 mg/mL還原型谷胱甘肽溶液10 μL，α-葡萄糖苷酶溶液20 μL，37 ℃保溫10 min后，加入將要測定的樣品20 μL，5 mmol/L PNPG溶液20 μL，在37 ℃條件下反應20 min后加入0.2 mol/L的Na2CO3溶液100 μL使反應終止，測定405 nm處光吸收值。同時設立背景對照組和空白組。

表1 淫羊藿苷及轉化產物、拜糖平對α-葡萄糖苷酶抑制活性

抑制率（%）＝[A空白-（A樣品-A背景）]/A空白×100%。計算公式中A空白為不加樣品反應結束后的吸光度值；A樣品為既加樣品又加酶反應結束后的吸光度值；A背景為只加樣品反應結束后的吸光度值。

2.6.2 標準曲線的制備：用pH為6.8的PB緩沖液配制50 mmol/L PNP，稀釋成5、2、1.0、0.5、0.25、0.1 mmol/L。分別取6種不同濃度的PNP溶液各100 μL加入到96孔板中，再加入0.2 moL/L Na2CO3溶液100 μL，振蕩混勻，在405 nm 條件下測定吸光度值，本實驗中測3組取其平均值。以吸光度的值為縱坐標，PNP濃度為橫坐標，繪制曲線。

2.6.3 α-葡萄糖苷酶活力的測定：向96孔板中加入pH=6.86的PB緩沖液35 μL，1.0 mg/mL還原型谷胱甘肽溶液10 μL，α-葡萄糖苷酶溶液20 μL，DMSO 15 μL，37 ℃保溫10 min后，加入5 mmol/L pNPG溶液20 μL，在37 ℃條件下反應20 min后加入0.2 mol/L的Na2CO3溶液100 μL使反應終止，測定405 nm處光吸收值。

酶活力單位定義：37 ℃，pH為6.86的條件下，每分鐘水解pNPG所產生1 μmoL PNP的酶量，規定為1個酶活力單位（U）[5]。

3 結果與討論

3.1 結構檢定：結合常規理化、核磁、質譜等分析測試方法對化合物Ⅰ～Ⅴ進行了鑒定，分別為淫羊藿次苷Ⅰ[6]、淫羊藿次苷Ⅱ[7]、水合淫羊藿素[7]、環淫羊藿素[7]、脫水淫羊藿素[7]。

3.2 淫羊藿苷及轉化產物對α-葡萄糖苷酶活性作用的比較：表1顯示，各化合物分別在0.5 mg/mL和2.5 mg/mL濃度下，對α-葡萄糖苷酶抑制活性，除環淫羊藿素和水合淫羊藿素外，其余均對α-葡萄糖苷酶有抑制活性。脫水淫羊藿素（IC50=0.102 mg/mL）的活性最好，且高于拜糖平（IC50=0.850 mg/mL）的活性。見圖1。

圖1 淫羊藿苷及轉化產物對α-葡萄糖苷酶活性的影響

4 結 論

首次利用體外抑制α-葡萄糖苷酶活性篩選模型對淫羊藿苷及轉化產物抑制α-葡萄糖苷酶活性進行了初步篩選，結果表明，淫羊藿苷及化合物Ⅰ～Ⅴ均具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。結果表明脫水淫羊藿素、淫羊藿次苷Ⅰ及淫羊藿次苷Ⅱ體外活性較淫羊藿苷好，水合淫羊藿素及環淫羊藿素的活性最差，脫水淫羊藿素（IC50=0.102 mg/mL）的活性最好，其活性較拜糖平（IC50=0.850 mg/mL）的活性更好，在較低的濃度下，能夠抑制α-葡萄糖苷酶的活性。

以PNPG為底物進行篩選中藥提取物或活性化合物，是目前最經典也是最常用的α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選方法[8-12]。整個過程快捷、經濟，特別適合用于α-葡萄糖苷酶抑制劑的初步篩選。本實驗對酶的活性及影響酶活性的因素（溫度、放置時間、DMSO的加入量）進行了考察，同時，也對整個反應體系有影響的因素終止劑的加入量、孵育時間、反應時間、酶濃度、反應底物的濃度進行了考察，得到穩定、科學合理的反應模型。以陽性對照藥拜糖平為對照，對模型進行了驗證，保證了反應體系的科學性。

淫羊藿為我過傳統中藥材，在中醫臨床應用廣泛。作者的研究結果對傳統中藥淫羊藿及淫羊藿苷的轉化產物在糖尿病治療方面的應用提供一定的理論依據。

[1] 顧覺奮,陳紫娟.α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究及應用[J].藥學進展,2009,33(2):62-67.

[2] 冉懋雄,魏德生,王曉春,等.貴州產淫羊藿資源與質量考察研究[J].現代中藥研究與實踐,2004,18(1):29-32.

[3] 袁航,曹樹萍,陳抒云,等.淫羊藿的化學成分及質量控制研究進展[J].中草藥,2014,45(24):3630-3640.

[4] Li T,Zhang X D,Song Y W,et al.A microplate-based screening method for alpha-glucosidase inhibitors[J].Chin J Clin Pharmacol Ther,2005,10(10):1128-1134.

[5] 康文藝,張麗,宋艷麗.茜草抑制α-葡萄糖苷酶活性成分研究[J].中國中藥雜志,2009,34(9):1104-1107.

[6] 韓冰,沈彤,劉東,等.黔嶺淫羊藿化學成分的研究Ⅱ[J].中國藥學雜志,2002,37(10):740-742.

[7] 張紅飛,閆利華,張啟偉,等.柔毛淫羊藿葉黃酮類成分研究[J].中國中藥雜志,2013,38(12):1942-1946.

[8] 顧覺奮,陳紫娟.α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究及應用[J].藥學進展,2009,33(2):62-67.

[9] 張雙慶,孫麗翠,黃振武.大鼠體內淫羊藿素葡萄糖醛酸代謝物的定量研究[J].衛生研究,2015,44(1):91-94.

[10] 孟繁興,李妍,葛廣波,等.基于淫羊藿次苷Ⅱ代謝行為的體外藥物相互作用研究[J].藥物評價研究,2016,39(4):539-546.

[11] 張淵,姚曉東,蘇吉,等.淫羊藿次苷Ⅱ納米脂質體的制備及包封率測定方法研究[J].遵義醫學院學報,2016,39(4):340-344.

[12] 孟繁興,李妍,盧芳,等.淫羊藿次苷Ⅱ葡萄糖醛酸代謝產物的制備與表征[J].中醫藥信息,2016,33(5):4-6.

R282.710.3

B

1671-8194（2017）01-0019-02

吉林省中醫藥科技項目（2014-Q39）

*通訊作者：E-mail:hyf_1992@163.com