同位素內標液相色譜-串聯(lián)質譜法測定嬰兒配方奶粉中雌二醇殘留

（上海市質量監(jiān)督檢驗技術研究院，上海200233）

同位素內標液相色譜-串聯(lián)質譜法測定嬰兒配方奶粉中雌二醇殘留

楊晉青，虞成華，薛峰，秦宇，王磊，劉洋

（上海市質量監(jiān)督檢驗技術研究院，上海200233）

建立了一種嬰兒配方奶粉中雌二醇殘留的高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜測定方法。樣品經乙腈提取、濃縮、正己烷凈化，用高效液相色譜分離后，采用電噴霧串聯(lián)質譜進行定性和定量檢測。線性范圍為5～100 ng/mL，線性相關系數(shù)r大于0.99，方法的定量檢出限為1.0 μg/kg（S/N=10）,高、中、低3個水平的加標回收率為81.5%～112.4%。

高效液相色譜；串聯(lián)質譜；嬰兒配方奶粉；雌二醇

0 引言

雌激素是一類可直接影響動物代謝和繁殖，具有相似化學結構的類固醇激素。該類物質進入機體后，可激活和抑制內分泌系統(tǒng)功能，造成機體代謝調控紊亂，甚至可導致發(fā)育異常或腫瘤等[1-2]，被歐盟等國在食用性動物飼養(yǎng)中列為禁用品[3]。目前，雌激素的殘留檢測研究主要集中在水產品、人血清、飲用水等[4-12]，在嬰幼兒奶粉中鮮見報道。嬰幼兒奶粉作為嬰兒除母乳外唯一的食物來源，其安全性對嬰幼兒的健康至關重要[13]。

本文針對應用最廣泛的類固醇激素——雌二醇，建立其在嬰幼兒奶粉中的檢測方法。采用高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀，在已有標準與文獻研究基礎上，優(yōu)化了提取凈化條件，利用同位素內標法進行定量，建立了嬰幼兒配方奶粉中雌二醇殘留的確證方法。為實現(xiàn)嬰幼兒奶粉中雌二醇殘留監(jiān)控，保障嬰幼兒奶粉的質量安全提供技術支撐。

1 實驗

1.1 材料與試劑

試劑：甲醇，乙腈，乙酸乙酯，正己烷，均為色譜純；氨水(分析純)，水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水（Milli-Q Synthesis超純水系統(tǒng)制備）。

標準品：雌二醇（CAS號：50-28-2）純度≥99.0%；雌二醇-13C2（100 μg/mL溶于乙腈中），于-20℃保存。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀，三重四級桿串聯(lián)質譜儀，NH2固相萃取小柱(500 mg，3 cc);其他設備包括超聲儀，旋轉蒸發(fā)儀，Vortex Genius 3型漩渦混合器，離心機。

1.3 標準溶液的配制

1.3.1 標準儲備溶液的配制

準確稱取10.0 mg的雌二醇標準品于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制備成質量濃度為1 000 mg/L標準儲備液。-18℃避光保存?zhèn)溆谩ＥR用前標準儲備液用甲醇稀釋成質量濃度為100 ng/mL的標準工作液；雌二醇-13C2則配制成質量濃度為1 mg/L的內標工作液。

1.3.2 基質混合標準工作曲線溶液配制

吸取不同體積標準儲備溶液，用空白樣品提取液配成不同質量濃度（ng/mL）的基質混合標準工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 儀器條件

1.4.1 超高效液相色譜條件:

色譜柱：C18高效液相色譜柱(Agilent ZORBAX SB-C18)。流動相：A為0.1%氨水溶液，B為乙腈，梯度洗脫步驟如表1所示；流速為0.2 mL/min；柱溫為30℃；進樣體積為10 L。

表1 梯度洗脫步驟

1.4.2 質譜條件

離子源為ESI源；掃描方式為負離子；氣簾氣為20 L/min；GS1為30 L/min；GS2為20 L/min；輔助加熱氣溫度為400℃；噴霧電壓為-4500 V；碰撞氣為高純氮氣（≥99.999%)；數(shù)據(jù)采集模式為MRM。定性定量離子對、碰撞能量等參數(shù)如表2所示，MRM結果如圖1所示。

表2 雌二醇的質譜參數(shù)

1.4.3 液相色譜-串聯(lián)質譜確證

定性測定：被測物質組分選擇1個母離子，2個子離子，在相同實驗條件下，樣品中待測物質的保留時間與標準溶液中的標準物質的保留時間偏差在±2.5以內；且樣品圖譜中待測組分定性離子的相對豐度接近標準溶液圖譜中對應的定性離子的相對豐度，若偏差不超過表3所規(guī)定的范圍，則可判定樣品中存在對應的待測物。

表3 定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差

定量測定：在儀器的最佳工作條件下，分別測定樣品和標準溶液中雌二醇的峰面積，以內標標準曲線法進行定量計算。

圖1 雌二醇標準品的多反應監(jiān)測圖

圖2 雌二醇標準品的碰撞誘導解離質譜圖

1.5 樣品前處理方法

1.5.1 提取

稱取5 g奶粉試樣，精確至0.01 g，置于50 mL離心管中，加入適量內標標準工作溶液，使其最終定容濃度均為10 ng/mL。加入10 mL水溶解，再加入25 mL乙腈，渦旋1 min，超聲10 min，然后加入5 g NaCl，振搖2 min，以10 000 r/min離心5 min后，以10 000 r/min離心5 min。上清液倒入100 mL雞心瓶中，殘渣再加入15 mL乙腈，重復上述操作一次。合并提取液，置于旋轉蒸發(fā)儀上，在45℃水浴中真空濃縮至干，準確加入2 mL乙腈水溶液（2+8）溶解殘渣（用于液液萃取凈化）；準確加入2 mL二氯甲烷-甲醇溶液（7+3）溶解殘渣（用于固相萃取凈化）。

1.5.2 凈化

1.5.2.1 液液萃取凈化

將上述溶液轉移至5 mL離心管中，加入1 mL正己烷，渦旋1 min，以4 000 r/min離心10 min。取下層清液，過0.22 μm濾膜后，用液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定。按上述操作步驟制備樣品空白提取液。

1.5.2.2 固相萃取凈化

用6 mL二氯甲烷-甲醇溶液（7+3）活化平衡小柱，取備用液上樣，控制流速不超過1滴/s；用10 mL二氯甲烷-甲醇溶液（7+3）洗脫，收集洗脫液，用微氮氣流吹干，用1.0 ml乙腈-水溶液(1+9)超聲溶解殘渣，漩渦混勻，過0.22 μm濾膜后，用液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定。按上述操作步驟制備樣品空白提取液。

2 結果與討論

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

實驗分別考察了Waters XbridgeTMC18和Agilent ZORBAX SB-C18兩根色譜柱在乙腈-水和甲醇-水兩種流動相洗脫下的分離效果。實驗表明，雌二醇在兩根C18柱的保留行為差別不大，采用甲醇-水體系作為流動相時易產生拖尾；考慮到節(jié)約成本和液相儀器的匹配問題，最終選用了Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18作為實驗用柱。同時，分別比較了水/甲醇，水/乙腈，0.1%氨水溶液/甲醇，0.1%氨水溶液/乙腈，2 mM乙酸銨/乙腈這幾種流動相對目標化合物離子化程度的影響，研究結果表明，采用0.1氨水溶液與乙腈作為流動相洗脫，獲得了理想的峰形，質譜信號最強。若在流動相中添加醋酸銨會使信號降低，這可能離子源中離子濃度過高會抑制雌二醇的電離，從而導致離子化效率下降的緣故。

2.2 質譜條件的優(yōu)化

雌二醇具有一定的弱極性或中等極性，選擇電噴霧(ESI)離子源分別在正離子、負離子模式下進行母離子全掃描，對比兩種模式，得出雌二醇負離子模式的離子峰強度比正離子峰強度高很多。而且其分子結構中含有酚羥基，因此選擇負離子模式檢測，首先進行一級母離子全掃描，確定其母離子，再用子離子掃描方式進行二級質譜掃描分析，，選擇豐度相對較高、質荷比較大的兩個特征離子碎片分別作為定量離子和輔助定性離子。通過優(yōu)化離子化電壓、離子源溫度、霧化氣、輔助加熱氣、氣簾氣，碰撞能量、去簇電壓等質譜參數(shù)，使雌二醇的母離子與特征碎片子離子的離子對強度達到最大。結果表明：雌二醇在負離子化模式下易形成一級特征離子峰[M-H]-271.0(m/z)和很強的二級特征離子峰為182.8(m/z)，具體的二級特征離子峰見圖2。

實驗中使用HPLC-MS/MS測定時有基質抑制效應存在．用陰性奶粉經過提取、凈化定容后配制的標準溶液和直接配制的同濃度標準溶液相比，信號下降30%左右，從而直接導致回收率偏低．為了補償由于基質抑制效應導致的測定數(shù)值偏差問題，采用基質匹配曲線(Matrix matched calibration curve)來校正最終結果。

2.3 樣品前處理方法的確定

本文采用乙腈作為提取溶劑，主要是考慮到乙腈在有效提取目標物的同時具有沉淀蛋白的作用，且?guī)С龅娜鯓O性成分較少。實驗中比較了用15 mL乙腈分別提取不同次數(shù)的提取效果，實驗結果表明提取兩次的回收率達到85%以上。超聲時間是對結果影響較大的因素之一，為此對不同超聲時間進行了試驗。分別選取了5 min，10 min和15 min三個時間點，在相同條件下對分析物進行測定，發(fā)現(xiàn)超聲10 min后，樣品的回收率就能達到90%以上。

2.4 基質效應

乳粉基質復雜，由于配方奶粉中含有較高脂肪，對雌二醇產生不同程度的基質抑制。提取凈化前添加待測物的基質抑制效應比提取凈化后添加待測物的基質抑制效應強，為了減少基質效應對雌性激素的抑制，通過液液萃取和SPE兩個方法凈化樣品，均可減少基體成分的干擾。選取正己烷去油脂進行樣品凈化，效果較好。綜合考慮各種影響因素，最終樣品提取方法選定用15 mL乙腈提取兩次，超聲時間為10 min，液液萃取凈化，以獲得最佳的回收率。

2.4 線性范圍和檢出限

線性范圍是指試樣量與響應訊號之間保持線性關系的范圍。將配制好的雌二醇標準貯備液用空白樣品提取液稀釋成質量濃度為5，10，25，50，100 ng/mL；按上述質譜條件分離測定，以質量濃度(P)和相應的定量離子峰面積比值(A)作線性回歸，得到雌二醇回歸方程為Y=0.00338X+0.00861，相關系數(shù)r=0.9986。在5～100 ng/mL范圍內線性關系良好。以一空白奶粉作為試驗樣品，加入一定量雌二醇標準品，按上述檢測方法測定，用質譜軟件進行測定，以S/N=3/1為最低定性限(LOD)，S/N=10/1為最低定量限(LOQ)，樣品的定量下限為1.0 g/kg。

2.5 回收率和精密度試驗

取經檢驗不含雌二醇的樣品，分別按樣品中1、2、10 g/kg含量水平添加一定量的雌二醇標準溶液，每一添加濃度重復6份樣品，按上述實驗方法測定，計算其回收率和精密度。得到1～10 g/kg添加水平范圍的回收率見表5。

表5 雌二醇回收率及精密度（n=6）

2.6 實際樣品測試

使用本文建立的檢測方法，對從超市中購買的30份嬰幼兒配方奶粉進行了檢測，結果均未檢出含有雌二醇。

3 結論

實驗結果表明，本文建立的HPLC-ESI-MS/MS方法具有特異性強、前處理簡單、重復性好等特點，與傳統(tǒng)的HPLC分離方法比較，分析時間大大縮短，靈敏度更高，定量下限為1.0 μg/kg。串聯(lián)質譜MRM采集方式的高選擇性使得方法的準確度更高，同時采用Agilent ZORBAX SB-C18(2.1 mm×100 mm，3.5 μ m)色譜柱使目標物和雜質得到較好的分離。該方法非常適合嬰幼兒奶粉中雌二醇殘留的快速檢測。

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Determination of estradiol residues in dairy products by isotope internal stan?dard-liquid chromatography tandem mass spectrometry

YANG Jinqing,YU Chenghua,XUE Feng,QIN Yu，WANG Lei,LIU Yang
（Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research，Shanghai 200233，China）

A sensitive method for determination of estradiol in infant formula by liquid chromatography tandem mass spectrometry（LC-MS/ MS）was established.The food sample was extracted by acetonitrile and concentrated and purified by n-hexane,then was separated and de?termined by HPLC-ESI-MS-MS.A linear calibration curve was obtained in the concentration range of 5～100 ng/mL.The linear correla?tion cofficients of the method are above 0.99.The detection limit of method（LOQ）is 1.0 μg/kg（S/N=10）.The recoveries in three levels rang from 81.5%～112.4%.

HPLC;mass spectrometry;infant formula;estradiol

TS252.7

：A

：1001-2230（2017）03-0055-04

2016-04-05

國家自然科學基金項目（31301486）；上海市自然科學基金項目（13ZR1439600）。

楊晉青（1983-），男，助理工程師，從事食品與化妝品分析測試。

劉洋