一株高效溶解鉀長石芽孢桿菌的分離鑒定與生物學特性研究①

謝慶東，何琳燕，王 琪，盛下放

(農業部農業環境微生物實驗室，南京農業大學生命科學學院，南京 210095)

一株高效溶解鉀長石芽孢桿菌的分離鑒定與生物學特性研究①

謝慶東，何琳燕，王 琪，盛下放*

(農業部農業環境微生物實驗室，南京農業大學生命科學學院，南京 210095)

從風化的鉀質粗面巖表面分離篩選到1株高效風化鉀長石的芽孢桿菌E31菌株，通過菌株的生理生化特征并結合菌株16S rDNA序列分析，E31菌株被鑒定為蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)。同時對E31菌株溶解鉀長石的效應與機制以及生物學特性進行了研究。結果表明，E31菌株能風化鉀長石并釋放出其中的元素，28℃ 振蕩培養不同時間，接菌處理發酵液中可溶性K、Fe、Ca、Al含量分別比對照提高了19.6% ～ 25.6%、1 ～ 12.5倍、10.4% ～47.2% 和1.2 ～ 4.5倍。在鉀長石存在條件下接菌處理發酵液pH為3.62 ～ 3.80，發酵液中葡萄糖酸含量達61 ～ 1 794 mg/L，發酵液細胞數量達 (8.7 ～ 16.1)×106cfu/ml，表明菌株可以通過代謝產生的有機酸來加速對鉀長石的分解作用。另外，E31菌株能夠合成生長素和鐵載體，E31菌株對溫度、pH和鹽濃度具有較強的耐受性。

鉀質粗面巖；鉀長石；蘇云金芽孢桿菌；礦物風化；葡萄糖酸；生物學特性

微生物–礦物相互作用是地球上廣泛發生的一種地質作用，微生物作用下硅酸鹽礦物的風化作用是表生環境中普遍存在的地球化學過程[1]。細菌可以通過產生的有機酸、胞外多聚物以及鐵載體等不同的機制加速土壤礦物的溶解，對于巖石風化、土壤形成以及土壤肥力的維持有重要的作用，同時在長時間尺度上對土壤環境和大氣CO2產生重要的影響[2–6]。芽孢桿菌(Bacillus spp.)是一類革蘭氏染色陽性、能夠產生抗逆性芽孢、好氧或兼性厭氧，且分布廣泛的一類細菌種群[7]。芽孢桿菌的芽孢對高溫、干燥、強電離輻射、紫外線、各種有害物質都有很強的抗性，良好的抗逆性使得它在各種惡劣的環境下可以正常地生長繁殖[8]。芽孢桿菌在礦物的生物風化和元素的釋放等方面的研究已受到人們的重視。Song 等[9]發現Bacillus subtilis能夠顯著增強礦物風化的速率；Basak 和Biswas[10]的研究表明，胨凍樣芽孢桿菌能夠風化云母并能夠活化淋溶土中的 K元素；黃智等[11]在搖瓶條件下研究了Bacillus altitudinis溶解鉀長石的效應，發現菌株能明顯降低發酵液的 pH并釋放礦物中的Fe、Si、Al、K等元素。雖然芽孢桿菌分解礦物及其機制的研究已有報道，但從風化的鉀質粗面巖表面分離篩選高效風化鉀長石的芽孢桿菌并研究其對鉀長石的溶解效能與機制等至今未見報道。本研究采用選擇性培養基，從鉀質粗面巖表面分離篩選到一株高效分解鉀長石的蘇云金芽孢桿菌，并探明該菌株溶解鉀長石的效能、機制及其生物學特性，豐富礦物風化芽孢桿菌資源庫，同時為研發高效微生物肥料、提高土壤礦質營養提供理論依據和菌種資源。

1 材料與方法

1.1 鉀長石和培養基

鉀長石(購自煙臺市華威礦業有限公司)元素組成：SiO263.6%，K2O 13.5%，Al2O318.4%，Fe2O31.7%，MgO 0.1%，CaO 0.04%。礦物樣品處理參照文獻[12]。礦物樣品研磨、過100 ～ 300目篩，去離子水超聲波清洗、鹽酸溶液浸泡、去離子水超聲清洗若干次，烘干備用。

BHm培養基：150 mg MgSO4?7H2O，80 mg NaH2PO4，90 mg Na2HPO4，65 mg (NH4)2SO4，20 mg CaCl2，2 g葡萄糖，1 L蒸餾水，調節pH至7.0；LB培養基：10 g 胰蛋白胨，5 g 酵母粉，10 g 氯化鈉，1 L 蒸餾水，調節pH至7.0；有氮改良培養基：10 g蔗糖，2 g K2HPO4，1 g (NH4)2SO4，0.5 g MgSO4?7H2O，0.1 g NaCl，1 L蒸餾水，調節pH至7.0。

1.2 芽孢桿菌分離、純化與篩選

采用LB培養基按文獻[12]分離。已風化鉀質粗面巖樣品采自南京小龍山鉀礦區(118°45′E，31° 47′N)。巖石樣品 10 g 加入 90 ml 無菌水中，充分振蕩(10 min)以制備成菌懸液，菌懸液置于80℃水浴鍋中水浴15 min以殺死非芽孢桿菌，采用稀釋涂布的方法分離巖石樣品中的芽孢桿菌，平板在 30℃培養3天后挑取單菌落并進行菌種劃線純化。

采用貧營養的 BHm培養基，以發酵液中有效Al含量的增加作為鉀長石溶解的標志。100 ml 塑料三角瓶中分裝BHm培養基30 ml，加入0.15 g 鉀長石粉，調節培養基pH為7.0，115℃ 滅菌30 min，將供試菌株分別接種于2 ml LB培養基中培養12 ～16 h，離心(8 000 r/min，5 min)收集菌體后，用無菌水洗滌2次后重懸于無菌水中，調整其OD600為0.8左右(108cfu/ml)，接種于每一只塑料瓶中，對照接等量滅活菌液，28℃振蕩(150 r/min)培養7天后分析發酵液中有效Al含量，以篩選高效分解鉀長石的芽孢桿菌菌株。發酵液中有效Al含量的測定：將發酵液10 000 r/min離心5 min，取上清液用電感耦合等離子發射光譜儀(ICP-OES)測定溶液中Al的含量。

1.3 高效菌株對鉀長石的溶解作用

高效菌株對鉀長石的溶解試驗同1.2。搖瓶培養時間分別為0、1、2、3、5、7和15 d，在不同培養時間取樣分析發酵液pH，細胞數量，有機酸以及其中有效態Fe、Al、K、Ca等元素的含量。發酵液pH采用pH計測定，細胞數量采用平板計數，發酵液高速離心(10 000 r/min，15 min)，0.25 μm 濾膜過濾，濾液用高效液相色譜法測定發酵液中有機酸，測定條件：色譜柱：C18 Agilent ZorbaxSB-AQ (4.6 mm × 250 mm)，流速0.6 ml/min，進樣量20 μl，流動相：0.02 mol/L KH2PO4(pH 2.4)和1% 色譜甲醇，檢測波長214 nm；發酵液有效態Fe、Al、K、Ca等元素的含量采用ICPOES測定。

1.4 高效礦物風化芽孢桿菌形態、生理生化特性與鑒定

按常規方法對菌株形態和生理生化特性進行分析。將菌株接種于滅菌的2 ml LB液體培養基，30℃、180 r/min振蕩培養12 h。取1.5 ml純培養物6 000 g離心5 min，細菌基因組總DNA的提取采用CTAB法[13]。菌株16S rDNA擴增采用細菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCGGCTCAG-3′)和 1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)，擴增片段長度為 1.5 kb。反應體系為 25 μl，包括 12.5 μl 2×Taq Master Mix，0.5 μl濃度為10 μmol/L的引物，1 μl DNA模板，10.5 μl ddH2O；PCR反應條件為95℃ 預變性5 min，95℃ 變性45 s，56℃ 退火45 s，72℃ 延伸1.5 min，30個循環，最后72℃ 延伸10 min。PCR產物用經EB染色的1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測。將獲得的序列用BLAST軟件與GenBank中已知的16S rRNA基因序列進行比對分析，鑒定菌株。

1.5 菌株產吲哚乙酸(IAA)和鐵載體能力測定

菌株產IAA能力測定采用王璐等[14]方法。將供試菌株接入有氮培養基中振蕩培養，發酵液離心，取上清液，加正磷酸和Sackowski’s顯色劑，混勻，黑暗下顯色，測定530 nm波長處吸光值。以IAA標準液作標準曲線，計算發酵液中IAA的濃度[15]。

菌株產鐵載體能力測定參照王璐等[14]方法。將供試菌株接入有氮液體培養基，振蕩培養，發酵液離心，取上清液加入CAS檢測液，混勻，以去離子水作對照，測定630 nm波長處的吸光值；取未接菌的LB液體培養基與CAS檢測液混勻，同法測定為參比值[16–17]。

1.6 溫度、初始 pH和鹽濃度對芽孢桿菌生長的影響

溫度、初始pH和鹽濃度對芽孢桿菌生長的影響采用王璐等[14]方法進行分析。將供試菌株點接于LB固體平板，分別在4℃、15℃、30℃、45℃和55℃的溫度下培養 72 h，觀察其能否生長及生長情況；用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH將LB培養基的pH調節至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。將活化的供試菌株分別點接于上述不同pH的培養基中，28℃ 培養72 h，觀察其能否生長及生長情況；按質量百分比濃度分別配制NaCl濃度為0.1%、0.5%、1.0%、5.0%、10%、20% 和 30% 的LB培養基，將供試菌株分別點接于上述培養基上，30℃ 培養72 h，觀察其能否生長。

1.7 數據處理

所有試驗數據均采用Microsoft Office Excel 2007處理，采用SPSS 19.0對數據進行方差分析。

2 結果與討論

2.1 芽孢桿菌的分離篩選

細菌廣泛分布在巖石(礦物)表面和土壤中[12,18]。采用熱處理和添加鉀長石的貧營養培養基(BHm培養基)篩選到18株能夠從鉀長石中釋放Al的芽孢桿菌，其中菌株 E31風化鉀長石的能力最強，接菌處理發酵液中的有效Al(0.53 mg/L)含量比對照(0.09 mg/L)增加了4.9倍，因此，以下試驗均以菌株E31為供試菌株。另外，供試鉀質粗面巖表面可培養細菌數量達2.86×106cfu/g，芽孢桿菌數量達3.24×105cfu/g，芽孢桿菌數量占總細菌數量的11.3%。

2.2 E31菌株對鉀長石的溶解作用及其機制

研究表明，細菌可以通過產生的有機酸、鐵載體、多糖以及氧化還原作用加速礦物的風化并釋放其中的元素[5,9,12,19]。由圖 1可以看出，芽孢桿菌E31菌株具有顯著的溶解鉀長石的能力。接菌處理的發酵液中有效性K、Ca、Fe、Al的含量分別比對照增加了19.6% ～ 25.6%、10.4% ～ 47.2%、1 ～ 12.5倍和1.2 ～ 4.5倍(圖1)。隨著培養時間的延長，菌株E31溶解鉀長石的能力增強，而對照處理發酵液中的K、Ca、Fe、Al含量沒有顯著變化。菌株E31在含鉀長石的貧營養培養基中能夠正常生長，培養1 d后發酵液中活細胞數量由初始的 1.4×106cfu/ml增加到1.5×107cfu/ml，培養時間在1 ～ 7 d內發酵液中活細胞數量沒有顯著變化，培養7 d后發酵液中的活細胞數量顯著下降(圖2A)。另外，菌株E31在風化鉀長石的過程中可以通過產酸來降低發酵液中的pH，培養1 d后，接菌處理的發酵液pH為3.66 ～ 3.80，而對照處理發酵液中的pH在培養過程中沒有顯著變化(圖2B)。菌株E31在含鉀長石的貧營養培養基中能夠大量合成葡萄糖酸，培養1 d后發酵液中葡萄糖酸含量最高(1 794 mg/L)，隨著培養時間的延長，發酵液中葡萄糖酸含量快速下降，培養后期發酵液中葡萄糖酸含量為61 ～ 66 mg/L(圖3)。由此可見，菌株 E31能夠在貧營養條件下通過細胞生長和代謝活動來降低發酵液中的pH，并通過發酵液的酸化作用和合成的葡萄糖酸的絡合作用來溶解鉀長石并釋放出其中的元素，增加發酵液中可溶性K、Ca、Fe、Al含量[5,12]。

圖1 E31菌株對K、Ca、Fe和Al的溶解作用Fig. 1 K, Ca, Fe, and Al releases from feldspar in presence of strain E31

圖2 發酵液細胞數量(A)和pH (B)的變化Fig. 2 Change of cell numbers and pH in culture medium in presence of strain E31

圖3 芽孢桿菌E31菌株合成的葡萄糖酸Fig. 3 Production of gluconic acid by strain E31 during feldspar weathering process

2.3 菌株E31的鑒定

菌株E31的鑒定主要依據16S rRNA序列并結合菌株基本特征進行。菌株 E31的基本特征：革蘭氏陽性、好氧、桿狀、菌體大小為(1.5 ～ 2.0) μm×(3.0 ～3.5) μm，能產生芽孢。在LB培養基上菌落為白色、圓形、邊緣不規則、厚實且較濕潤、易挑取。將E31菌株16S rRNA序列在數據庫中進行相似性比對，采用MEGA 5.0軟件經臨近法(Neighbor-joining)構建系統發育樹(圖4)。由系統發育樹可以看出，菌株 E31與Bacillus thuringiensis ATCC 10792T(ACNF01000156)的16S rRNA基因序列相似性為100%。因此，E31菌株被鑒定為Bacillus thuringiensis。

圖4 基于16S rDNA 序列系統發育樹(鄰接法)Fig. 4 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

2.4 蘇云金芽孢桿菌E31菌株產生長素和鐵載體能力

菌株E31具有產IAA的能力，產量為30.8 mg/L。鐵載體是一類特異性螯合劑，是微生物在限鐵條件下(即鐵離子濃度較低時)產生并分泌的一種低分子量(＜1 000 Da)、能夠螯合Fe (III) 離子的化合物。本試驗采用CAS通用檢測法檢測供試菌株產鐵載體的能力[16–17]。根據A/Ar比值(即菌株測定值/對照值)對細菌鐵載體產量進行半定量比較，A/Ar比值越小菌株產鐵載體能力越強[15–16]。菌株 E31的 A/Ar比值為0.45(在0.4 ～ 0.6范圍內)，產鐵載體能力中等。

2.5 蘇云金芽孢桿菌E31菌株對環境的適應能力

蘇云金芽孢桿菌E31菌株對不同的溫度、pH和鹽濃度等表現出一定的耐受性。菌株E31為中溫菌，在15 ～ 37℃下能較好生長，最適生長溫度為30℃左右；菌株E31生長的pH范圍是3 ～ 10，最適生長pH 7.0；菌株E31在0.5% ～ 20% 的NaCl中良好生長，最適生長鹽濃度為1.0% NaCl，值得注意的是，菌株E31耐高滲能力較強，在20% NaCl中能夠正常生長。

3 結論

1) 從風化的鉀質粗面巖表面分離篩選到一株高效風化鉀長石的蘇云金芽孢桿菌E31菌株。

2) 研究表明，蘇云金芽孢桿菌E31菌株能夠顯著促進鉀長石的溶解并釋放出其中的 Fe、K、Al、Ca等元素，E31菌株主要通過培養基的酸化和合成的葡萄糖酸加速鉀長石的風化。

3) E31菌株能夠合成植物促生物質生長素和鐵載體，同時對溫度、酸堿有一定的耐受性，尤其具有較強的耐高滲能力。

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Isolation and Identification of a Feldspar-dissolving Bacillus Strain and Its Biological Characteristics

XIE Qingdong, HE Linyan, WANG Qi, SHENG Xiafang*
(Key Laboratory of Agricultural and Environmental Microbiology, Ministry of Agriculture, College of Life Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

One mineral-weathering Bacillus strain was isolated from the surface of weathered potash trachyte and was identified as Bacillus thuringiensis based on the physiological and biochemical traits and 16S rDNA sequence analysis. The dissolution of feldspar by strain E31 and the mechanism involved as well as the biological characteristics were characterized. The results showed that strain E31 could weather feldspar and release elements from the mineral. The concentrations of K, Fe, Ca, and Al were increased by 19.6%–25.6%, 1–12.5 times, 10.4%–47.2% and 1.2–4.5 times in the presence of strain E31 compared with the controls respectively during the mineral weathering process. pH value, gluconic acid content, and cell numbers in the culture medium were 3.62–3.80, 61–1 794 mg/L, and (8.7–16.1)×106cfu/ml, respectively, in the presence of strain E31, suggesting that strain E31 could promote the mineral weathering by increasing the production of organic acids in the culture medium. Furthermore, E31 strain has the ability to produce IAA and siderophores in culture medium and also has the characteristics of acid or alkali and salt tolerance and temperature resistance.

Potash trachyte; Feldspar; Bacillus thuringiensis; Mineral weathering; Gluconic acid; Biological characteristics

Q93；S1

A

10.13758/j.cnki.tr.2017.02.014

國家自然科學基金項目(41473075)資助。

* 通訊作者(xfsheng@njau.edu.cn)

謝慶東(1990—)，男，山西晉城人，碩士研究生，主要從事硅酸鹽礦物–細菌相互作用研究。E-mail: 2013116076@njau.edu.cn