土壤微生態環境對櫻桃樹“黑疙瘩”病發生的影響①

楊 璐，杜巖新，徐利娟，黃建新

(西北大學生命科學學院，西安 710069)

土壤微生態環境對櫻桃樹“黑疙瘩”病發生的影響①

楊 璐，杜巖新，徐利娟，黃建新*

(西北大學生命科學學院，西安 710069)

研究陜西“黑疙瘩”病櫻桃樹根際土壤微生態環境，分析其對櫻桃樹“黑疙瘩”病發病的影響，可為后期防治工作提供理論和實踐依據。本研究采用傳統微生物學、分子生物學及生物化學相結合的方法，對陜西白鹿原發病櫻桃樹根際土壤理化性質、土壤酶活性及可培養微生物數量、優勢細菌種類與健康櫻桃樹根際的差異進行了分析，結果表明：健康櫻桃樹根際土壤全磷、速效鉀、有效磷、堿解氮平均含量高于病株根際，土壤有機碳含量低于病株根際，而土壤全氮、全鉀含量及pH根際間差異不顯著；健康櫻桃樹根際土壤蛋白酶、脲酶、轉化酶及多酚氧化酶活性高于病株根際，而脫氫酶和過氧化氫酶活性低于病株根際。土壤根際微生物分析表明，健康櫻桃樹根際土壤的可培養細菌、放線菌數量顯著高于病株根際，尤其是優勢細菌種類及數量；而霉菌平均數量則相反，但差異不顯著。因此，根際土壤可培養細菌、放線菌的減少及優勢細菌分布不均，以及速效養分的減少、酶活性的降低可能是影響櫻桃樹“黑疙瘩”病發生的原因之一。

櫻桃樹；黑疙瘩病；土壤微生態環境

櫻桃(Cerasus pseudocerasus)，某些李屬類植物的統稱，因其果實外表晶瑩剔透、色澤鮮艷且富含多種營養元素，作為水果食用備受人們的喜愛。國內現已有許多大型櫻桃產地，陜西白鹿原萬畝櫻桃園就是其一，櫻桃產業已成為陜西農業發展的重要支柱。但近年來該地區的櫻桃樹出現一種嚴重的病害，癥狀為地上樹干、樹枝及分叉處木質部凸起形成深褐色、黑色瘤狀病斑并伴有流膠現象。實地調查發現該癥狀是已有研究報道中的根癌病、流膠病以及枝枯病癥狀的綜合。其與根癌病最為相似，但兩者發病部位不同，根癌病發病部位主要集中在近表土樹根部，樹枝上少有[1]，但陜西白鹿原所發現的病害樹根部感染極少，且經調查多年來農民按照冠癭病所進行的治療是無效的，當地農民根據病狀的表征稱其為“黑疙瘩”病。該病害傳播速度快，同一果園在3年內感染率高達80%，減產20% 以上，嚴重時甚至出現毀園現象。因其病狀特殊，故下文中也稱其為“黑疙瘩”病。

根際土壤微生態環境與植物健康狀況之間的關系已成為近年來研究的熱點。已有研究表明，果樹根際土壤狀況與果樹的抗逆性和病害的發生密切相關[2]。由于目前陜西櫻桃樹這種病害產生的原因尚無定論，因此，本研究擬通過分析病害園(發病率高達90%)與健康園(發病率為0)櫻桃樹根際土壤的理化特征、酶活性，以及可培養微生物數量、優勢細菌的種類差異來分析病狀發生的可能原因，以期為防治櫻桃病害提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品的采集與處理 土壤樣品在2014年7月采集于陜西省白鹿原櫻桃園(108°59′ ～ 109°16′E，34°10′ ～ 34°27′N)。選取連作6年紅燈櫻桃品種的兩個櫻桃園，健康園(約0.2 hm2)位于龍灣村，發病率為 0；病害園位于西塘村田園櫻桃標準示范園(約1 hm2)，發病率約90% 以上。兩個櫻桃園在地理位置上相隔約10 km，土壤均為黃土類型。采用五點取樣法分別對櫻桃健康園和病害園中各 7株櫻桃樹采集其根際土壤[3]，健康園樣品編號為J1 ～ J7；病害園均為病情嚴重植株，編號為B1 ～ B7。采集的土樣分別放于滅菌平皿中并用保鮮袋獨立包裝，快速運回實驗室，放于–4 ℃冰箱中保存。

1.1.2 所用培養基[4]牛肉膏蛋白胨培養基用于細菌分離培養；高氏1號培養基(加入1% 的苯酚溶液)用于放線菌分離培養；馬丁氏培養基用于真菌的分離培養。

1.2 方法

1.2.1 根際土壤理化性質的測定 依據《土壤農化分析》[5]分別測定健康與患病櫻桃樹根際土壤有機碳、全氮、全磷、全鉀、堿解氮、有效磷、速效鉀的含量；按照《土壤質量——pH的測定(ISO 10390: 2005)》分別測定根際土壤pH。

1.2.2 根際土壤酶活性的測定 土壤中積累的酶種類很多，本研究主要檢測與植物生長相關的6種酶類：過氧化氫酶(CAT)活性采用高錳酸鉀滴定法測定[6]，以1 g土壤消耗0.1 mol/L高錳酸鉀(對照與試驗滴定的差) 的體積(ml)來表示；脲酶活性采用苯酚鈉–次氯酸鈉比色法測定[6]，以1 g土壤產生NH3-N的質量(mg)來表示；轉化酶活性采用Na2S2O3滴定法測定[6]，以1 g土壤消耗0.1 mol/L硫代硫酸鈉(對照與試驗滴定的差)的體積(ml)來表示；多酚氧化酶(PPO)活性采用鄰苯三酚比色法測定[6]，以1 g土壤產生的 棓紅紫 精(purpurogallin)的質量來表示；脫氫酶(DHA)活性采用TTC法測定，以1 g土壤產生的三苯基甲 臜質量(mg)來表示[6]。蛋白酶活性采用的改良茚三酮法測定，以 1 g土壤 50℃培養 2 h產生的NH2-N 質量(mg)來表示[7]。

1.2.3 根際土壤可培養微生物數量及優勢種群的測定 土樣于無菌水中梯度稀釋，以平板菌落計數法進行微生物數量計數：細菌選取稀釋度為10–4～ 10–6；放線菌稀釋度為 10–3～ 10–5；霉菌稀釋度為 10–3～10–5，每組設置 3個重復。30℃恒溫培養，細菌培養2 d、放線菌培養6 d、霉菌培養4 d，觀察結果并記錄。

優勢細菌為最大梯度(均為10–6)平板菌落，分別挑取平板所有菌落并純化，根據《伯杰細菌鑒定手冊》[8]及《常用細菌系統鑒定手冊》[9]對純化的優勢細菌進行初步鑒定歸類。同時提取不同菌落 DNA，以細菌16S rDNA 引物27F和1495R對提取的DNA進行PCR擴增，送上海生工生物工程有限公司測序，測序結果在NCBI上BLAST鑒定。

1.2.4 數據統計分析 用 Microsoft Office、Origin等軟件對實驗數據進行處理并繪圖；用SPSS 20.0 對數據進行統計及差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 健康園與病害園櫻桃樹根際土壤理化性質差異

經測定，健康與患病櫻桃樹根際土壤的pH均在6.8 ～ 7.5，二者差異不顯著。其根際土壤的主要營養元素含量測定結果見圖1。由圖1E、F、D、B可見：健康園櫻桃樹根際土壤全磷、有效磷、速效鉀、堿解氮的平均含量高于病害園櫻桃樹根際，且分別是其平均含量的1.17倍、1.26倍、1.42倍、1.07倍；健康園櫻桃樹根際土壤有機碳平均含量明顯低于病害園櫻桃樹根際(圖1G)；兩園根際土壤的全氮、全鉀含量差異并不顯著(圖 1A、C)。由此可見，病害嚴重的櫻桃樹根際土壤中植物可直接利用的營養元素相對健康櫻桃樹根際呈現減少的趨勢。

2.2 健康園與病害園櫻桃樹根際土壤酶活性差異

根際土壤酶來源于微生物細胞產生釋放的外酶、內酶及一些結構酶類，是土壤新陳代謝的重要因素[10]，有促進土壤中腐殖質、植物動物殘體的分解的作用，并且被作為評價土壤肥力以及健康狀況的一個良好潛在指標[11]。

本研究健康與患病櫻桃樹根際土壤酶活性測定結果見圖2。由圖2A、B、C、D可見：健康園櫻桃樹根際土壤中蛋白酶、脲酶、轉化酶和多酚氧化酶活性平均值高于病害園櫻桃樹根際，且是其平均含量的1.92倍、10.23倍、1.67倍、1.61倍；脫氫酶、過氧化氫酶酶活性平均值則低于病害園櫻桃樹根際，呈現為脫氫酶平均活性值是健康園櫻桃樹根際土壤 2.25倍(圖2F)，過氧化氫酶活性平均值兩園間則差異不大(圖2E)。可見，患病櫻桃樹根際土壤中大部分酶活性相對健康櫻桃樹根際呈現減弱的趨勢，不利于營養物質的轉化循環及有機體的分解與代謝[6]。

2.3 健康園與病害園櫻桃樹根際土壤可培養菌群差異

2.3.1 可培養微生物數量 土壤微生物對植物根系養分吸收、土壤肥力形成、營養物質分解轉化都有非常重要的作用[2]。健康和患病櫻桃樹根際土壤中細菌、放線菌及霉菌數量測定結果見表1。表1數據表明，健康櫻桃樹根際土壤細菌、放線菌數量平均值分別是患病櫻桃樹根際的2.04倍、1.64倍，且差異顯著；霉菌數量平均值表現為患病櫻桃樹根際大于健康櫻桃樹根際，但差異不顯著。可見，患病櫻桃樹根際土壤細菌及放線菌數量相對健康櫻桃樹根際土壤有所減少，而霉菌數量則有所增加。

圖1 健康與患病櫻桃樹根際土壤營養元素的對比Fig. 1 Comparison of nutrient elements in healthy and diseased rhizosphere soils of cherry tree

2.3.2 優勢細菌種類 從健康園櫻桃樹根際土壤中分離出優勢細菌145株，病害園櫻桃樹根際土壤中分離出89株，通過形態學和生理生化分析鑒定，將結果相似的菌株進行歸類，其中健康園的145株優勢細菌可歸為16種相似菌株；病害園的89株優勢細菌歸為15種相似菌株。分別進行16S rDNA測序，結果見表2。

健康櫻桃樹根際土壤分離出來的 145株菌分別屬于9個不同的屬；患病樣品分離出來的89株菌分別屬于8個不同的屬。健康與患病櫻桃樹根際土壤優勢細菌種類組成情況如圖3所示。

從圖3中可見，兩種土壤中細菌類群存在一定的差異性，具體表現在健康櫻桃樹根際土壤優勢種屬包括芽孢桿菌屬(Bacillus)、微小桿菌屬(Microbacterium)、考克氏菌屬(Kocuria)、類芽孢桿菌屬(Arthrobacter)，其占總量比例依次為 25.52%、19.31%、17.93% 和12.41%；患病櫻桃樹根際土壤中僅芽孢桿菌屬(Bacillus)是最明顯的優勢種屬，所占比例為44.94%。僅在健康櫻桃樹根際土壤中發現的種屬有壤霉菌屬(Agromyces)、貪噬菌屬(Variovorax)；患病櫻桃樹根際土僅有的是微球菌屬(Micrococcus)。可見，患病櫻桃樹根際土壤相比健康櫻桃樹根際細菌優勢菌的種類、數量減少，而且菌群結構比例發生變化。

圖2 健康與患病櫻桃樹根際土壤酶活性值對比Fig. 2 Comparison of enzyme activities between healthy and diseased rhizosphere soils of cherry tree

表1 健康與患病櫻桃樹根際土壤微生物數量Table 1 Numbers of microorganisms in healthy and diseased rhizosphere soils of cherry tree

3 討論

根際微環境是一個由植物根系細菌、真菌、放線菌及土壤動物組成的多因素相關聯的復雜系統[12]，是植物和微生物交流活躍的土壤微區[13]。本研究中患病櫻桃樹根際土壤養分平均含量相對較低的有效磷、速效鉀、堿解氮均是植物可直接利用的營養[14]，由此可見患病櫻桃樹根際土壤的速效肥力差且營養缺失嚴重；而患病櫻桃樹根際土壤的有機碳平均含量相對較高，這可能是患病植株落葉過多所導致的[15]。

患病櫻桃樹根際土壤平均酶活性值較低的有蛋白酶、脲酶、轉化酶和多酚氧化酶，其中脲酶、蛋白酶參與土壤生態系統氮素循環，尿素的分解，與土壤中氮素的含量呈正相關[16]；轉化酶與土壤中微生物呼吸強度呈正相關[6]；多酚氧化酶與土壤腐殖質程度呈正相關[17]。由此可見，患病櫻桃樹根際土壤肥力、熟化程度以及微生物活性都不及健康櫻桃樹根際高。其中，健康櫻桃樹根際土壤脲酶活性是患病櫻桃樹根際的10倍，差異最大，結合營養元素結果可見患病根際土壤氮素缺失嚴重。而患病櫻桃樹根際土壤酶活性較高的僅有脫氫酶，這可能是因為脫氫酶與土壤中碳源有密切關系[18]，患病櫻桃樹根際土壤有機碳含量高所導致的。

表2 健康與患病櫻桃樹根際土壤優勢細菌鑒定結果Table 2 Numbers of microorganisms in healthy and diseased rhizosphere soils of cherry tree

圖3 健康與患病櫻桃樹根際土壤細菌優勢菌種類組成Fig. 3 Composition of dominant bacterium species in healthy and diseased rhizosphere soils of cherry tree

根際土壤微生物是土壤–根系間養分轉化和轉運的調節器[19]。健康櫻桃樹根際土壤的細菌、放線菌數量相對患病櫻桃樹根際較多且差異顯著，而兩園霉菌數量表現為差異不顯著。優勢細菌的鑒定結果顯示，患病櫻桃樹根際土壤的優勢細菌數量及種類不僅少于健康櫻桃樹根際且菌群結構比例發生變化，其土壤優勢細菌考克氏菌屬、微小桿菌屬、類芽孢桿菌屬比重降低且缺少壤霉菌屬和貪噬菌屬。綜合土壤微環境菌群的數量及種類差異，可能是患病櫻桃樹根際土壤菌群結構比例變化后病菌入侵引起病害，進而患病植株營養傳輸阻斷，造成根際土壤營養不均衡，不利于微生物的生長，土壤失去自我修復的能力，植物病害持續加重。

4 結論

通過比較健康與患病櫻桃樹根際土壤微環境，發

現在自然環境相同的條件下，患病植株根際土壤相對健康樣品氮、磷、鉀速效肥力及催化氮素轉化循環的酶活性減弱；細菌、放線菌數量，尤其是優勢細菌種類及數量減少且菌群結構比例發生變化。由此可見，速效養分氮的減少及微生物菌落的變化可能是導致櫻桃樹“黑疙瘩”病發生的原因。

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Effects of Soil Microecological Environment on Occurrence of‘Black Humor’ Disease in Cherry Tree

YANG Lu, DU Yanxin, XU Lijuan, HUANG Jianxin*
(College of Life Sciences, Northwest University, Xi’an 710069, China)

The methods of traditional microbiology, molecular biology and biochemistry were combined to study the differences of rhizosphere soil physical and chemical properties, soil enzyme activities and the culturable microorganism diversities between healthy and diseased cherry trees in the White Deer Prairie Shaanxi for the prevention and control of ‘Black tumor’ disease. The results showed that the contents of total phosphorus, available potassium, available phosphorus and available nitrogen of healthy rhizosphere soil were significantly higher than those of diseased one, organic carbon content of healthy rhizosphere soil was significantly lower than that of diseased one. Total nitrogen, total potassium contents and pH had no significant difference between healthy and diseased rhizosphere soils. The activities of protease, urease, invertase and PPO enzymes of healthy rhizosphere soil were much higher than those of diseased one, but the activities of DHA and CAT enzymes of healthy rhizosphere soil were lower. The population of culturable bacteria and actinomyces of healthy rhizosphere soil were significantly more than diseased one, particularly of dominant bacteria, the mean population of streptomyces of healthy rhizosphere soil were lower than those of diseased one but without significant difference. The decrease of the number of culturable bacteria and actinomycetes, the imbalance proportion of dominant bacteria in the rhizosphere soil, the decrease of available fertilizer and enzyme activities may be the causes of Black tumor disease.

Cherry tree; Black tumor disease; Soil microecological environment

Q93

A

10.13758/j.cnki.tr.2017.02.015

陜西省自然科學基金項目(SJ08ZT08-2)資助。

* 通訊作者(jxhuang@nwu.edu.cn)

楊璐(1991—)，女，山西運城人，碩士研究生，研究方向為應用微生物學。E-mail: lululily91@163.com