兩種繪制枯草芽孢桿菌和大腸桿菌生長曲線方法的比較

何嵐　王柳懿　朱琪　喬家運　王文杰

摘 要：利用分光光度法和活菌計數法對大腸桿菌O78和枯草芽孢桿菌CGMCC 1.504的生長曲線進行測定，并根據兩種方法在細菌對數生長期的線性關系，篩選相關系數最大的吸光度。結果表明：大腸桿菌O78培養中0～2 h為遲緩期，2～12 h為對數生長期，12～20 h為穩定期，20 h以后進入衰亡期。枯草芽孢桿菌CGM培養中0～2 h為遲緩期，2～12 h為對數生長期，12～18 h為穩定期，18 h以后進入衰亡期。在兩種細菌的對數生長期，分光光度計測出不同吸光度下的OD值和活菌計數法測得的細菌數都表現出一定的線性關系，且在吸光度為630 nm時，O78和CGM的OD值和活菌數相關系數最大（R2O78 = 0.991 2，R2CGM = 0.990 4），相關程度最高。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌；大腸桿菌；生長曲線；分光光度法；活菌計數法

中圖分類號：Q936 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.05.004

Abstract： Escherichia coli O78 and Bacillus subtilis CGMCC 1.504 growth curves were determined by spectrophotometric method and viable count method，using the linear relationship of two methods in logarithmic growth period of bacteria to select the absorbance maximum of the correlation coefficient. The results showed that 0～2 h was in the lag phase； 2～12 h was in logarithmic growth phase in the cultivation of Escherichia coli O78； 12～20 h was stable， after 20 h O78 entered into decline phase. In the cultivation of Bacillus subtilis CGM， 0～2 h was in the lag phase； 2～12 h was in logarithmic growth phase； 12～18 h was stable， after 18 h CGM entered into decline phase. In logarithmic growth phase of two germs， the number of bacteria was measured by OD value in different absorbance and the number of live bacteria measured by viable counting method showed a linear relationship. Besides， in absorbance of 630 nm， the OD value of O78 and CGM were related to the highest degree with live bacteria， and the correlation coefficient maintained maximum （R2O78 = 0.991 2， R2CGM = 0.990 4）.

Key words： Bacillus subtilis； Escherichia coli； growth curve； spectrophotometry； viable counting method

禽致病性大腸桿菌（Escherichia coli）O78在禽類腸道中廣泛存在，易引起雞及其它禽類的腸道炎癥及腸外疾病，如心包炎、氣囊炎、肝周炎等，甚至引起敗血癥而導致急性死亡[1-2]。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CMCC1.504是飼料中常添加的益生菌，在動物體內可產生各類酶，如α-淀粉酶、蛋白酶、甘露聚糖酶等[2]，利用枯草芽孢桿菌制備發酵飼料，可將飼料中的蛋白質水解成氨基酸、小肽和多肽類等物質。枯草芽孢桿菌中蛋白酶、淀粉酶的活性很高，可以促進動物機體對營養物質的吸收利用，從而促進生長發育，提高飼料利用率。枯草芽孢桿菌的芽孢體易保存，能耐受極酸或高溫環境，可在適宜的條件下將粗纖維、非蛋白氮和寡糖等不易消化吸收的物質轉化為優質的菌體蛋白，因此，在生產實踐中常用作飼料發酵菌種[3-5]。

本試驗利用分光光度法和活菌計數法分別測定大腸桿菌O78和枯草芽孢桿菌CGMCC 1.504的生長性能，得到在不同吸光度下培養液的OD值和活細菌數，繪制二者的生長曲線，并對根據兩種測定方法所繪制的生長曲線進行比較分析。此外，利用兩種計數方法繪制出線性回歸方程，并根據相關系數確定最佳吸光度，從而可以更深入地了解兩種細菌的生長繁殖規律和生理特性，這對根據不同需要有效地利用和控制大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的生長具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

菌種：大腸桿菌O78和枯草芽孢桿菌CGMCC1.504（以下簡稱CGM）由天津市畜牧獸醫研究所微生物實驗室保藏。

LB 培養基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL（加固體瓊脂粉20 g），調pH值7.0，121 ℃下高壓滅菌15 min，備用。

麥康凱瓊脂培養基：取麥康凱52 g，加熱溶于1 000 mL蒸餾水中，121 ℃下高壓滅菌15 min，備用。

肉湯培養基：蛋白胨 10 g，牛肉膏 3 g，氯化鈉 5 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃下高壓滅菌15 min，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 O78和CGM 種子液的培養 將保存于斜面的大腸桿菌O78接一菌環到肉湯培養基中，37 ℃，150 r·min-1，培養16～18 h，置于冰箱4 ℃保存，備用。

將保存于斜面的枯草芽孢桿菌CGM接一菌環到液體LB培養基中，37 ℃，150 r·min-1，培養16 ～18 h，置于冰箱4 ℃保存，備用。

1.2.2 O78和CGM不同生長時間培養液的收集 試驗分為A、B兩組，每組按照培養時間的不同分別取14個時間點。具體分組方法如下：取30個150 mL已滅菌的錐形瓶，其中A組15瓶裝入20 mL液體LB培養基，B組15瓶裝入20 mL肉湯培養基，從兩組中各取一瓶標注為KA和KB，作為空白對照。將A組14個錐形瓶裝入CGM培養液0.32 mL（接種量1.6%）[6]，B組14個錐形瓶裝入O78培養液0.2 mL（接種量1%），震蕩搖勻后，分別標記為0，1，2，3，4，6，8，10，12，14，16， 18，20， 24。將標有KA、KB和0的錐形瓶取出，立即放入4 ℃冰箱，保存備用。將其余已接入培養液的26個錐形瓶于37 ℃，150 r·min-1震蕩培養，相應時間后取出錐形瓶，放入4 ℃冰箱，保存備用。

1.2.3 O78和CGM不同生長時間培養液OD值的測定 以無菌的液體培養基KA、KB作空白對照，在600 nm波長下，用光程1 cm的比色皿通過比濁法測定O78和CGM不同生長時間培養液的OD值。分別于培養的0，1，2，3，4， 6，8，10，12， 14，16，18，20，24 h時取出3 mL菌液，分別測定450，490，570，600，630，650 nm吸光度下的OD值，每個時間點重復測定3次取其平均值。

1.2.4 活菌總數計數 采用平板計數法，將菌液逐級稀釋，分別稀釋至10-5，10-6，10-7，10-8，10-9混勻，取400 L涂平板，37 ℃，培養24～36 h，選取菌落數30～300為有效計數平皿，進行計數。依照下式計算出O78和CGM各生長時間的細胞密度（cfu·mL-1）：

CFU=（C÷V）×M

式中：C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數，V代表涂平板時所用稀釋液的體積，M代表稀釋倍數。

2 結果與分析

2.1 O78和CGM不同吸光度下培養液的OD值和活菌數

O78和CGM不同吸光度下培養液的OD值和活菌數見表1、表2。

2.2 O78不同吸光度培養液的OD值培養時間的關系

以培養時間為橫坐標，OD值為縱坐標，作O78的生長曲線，結果如圖1。

2.3 CGM不同吸光度培養液的OD值培養時間的關系

以培養時間為橫坐標，OD值為縱坐標，作CGM的生長曲線，結果如圖2。

2.4 O78和CGM的活菌數和時間的關系

以培養時間為橫坐標，活菌數為縱坐標，作O78和CGM的生長曲線，結果如圖3。

2.5 不同吸光度O78和CGM在對數生長期的OD值與活菌數的函數關系

以OD值為橫坐標，活菌數的對數為縱坐標，繪出不同吸光度下兩者間的回歸曲線。 O78不同吸光度下的回歸方程見圖4，CGM不同吸光度下的回歸方程見圖5。結果表明，在吸光度為630 nm時，O78和CGM的OD值和活菌數均表現出較強的相關性（R2O78 = 0.991 2，R2CGM =0.990 4），相關系數最大。

3 結論與討論

生長曲線是描述生物生長繁殖變化的曲線[7]。以細菌的培養時間為橫坐標、以其數目的對數或生長速率為縱坐標作圖所繪制的曲線稱為該細菌的生長曲線。細菌生長曲線的繪制方法有很多，有血細胞計數法、活菌計數法、稱重法、分光光度法等。其中應用最廣泛的主要有分光光度法和活菌計數法兩種。分光光度法是通過一定的吸光度測定菌液的OD值，測得的菌液中包含的是總菌數，該方法操作簡便，耗時較短。活菌計數法得出的是菌液中的活菌數，其結果較分光光度法要準確得多，但操作復雜且耗時、耗力。因此，將兩種方法結合起來，在使試驗方法變得更簡便的同時也能保證結果的準確性，就顯得尤為關鍵。

在嚴格控制培養條件的前提下，可通過測定培養液的OD值來推算對數生長期的活菌數，代替活菌計數法。在生產實踐中也可以將細菌OD值作為判斷細菌是否進入對數生長期的依據[8]。利用分光光度法和活菌計數法測定細菌的生長曲線，在停滯期和對數期測定的結果基本一致[8-9]。對于某些細菌而言，這兩種計數方法繪制的生長曲線有很好的相關性[10-12]。分光光度法測定的是細菌總數，而活菌計數法測定的是活菌數。因此，進入穩定期后兩種方法的測定結果顯著不同[13]。

生長曲線反映了細菌在不同的培養條件下所表現出的生長規律和繁殖特點。不同的細菌在相同的培養條件下生長曲線會有不同，即使是同一種細菌在不同的培養條件下所繪制的生長曲線也不相同[14]。王升智等[15]研究表明：重組大腸桿菌DH5α的生長經歷了遲緩期、對數期、穩定期、衰亡期4個時期，符合細菌生長的規律；重組大腸桿菌生長至平臺期時提取質粒的量最多。熊海燕等[16]采用濁度法測量發酵液濃度，確定波長為560 nm，以新鮮蘋果汁、柑橘汁為原料，進行生長曲線的測定，發現菌種的生長規律基本保持同一性。李麗等[17]采用分光光度法測定產氨短桿菌不同生長時間的生長曲線圖，同時利用活菌菌落計數法繪出生長曲線進行進一步驗證。結果表明：產氨短桿菌在適宜生長條件下經歷遲緩期、對數期、穩定期和衰亡期4個時期，符合細菌生長的規律。

本試驗結果表明，大腸桿菌O78培養中0～2 h為遲緩期，2～12 h為對數生長期，12～20 h為穩定期，20 h以后進入衰亡期。枯草芽孢桿菌CGM培養中0～2 h為遲緩期，2～12 h為對數生長期，12～18 h為穩定期，18 h以后進入衰亡期。O78 和CGM培養液在不同吸光度下的OD值和活菌數在對數生長期均表現出很好的相關性，且在吸光度為630 nm時，O78和CGM的OD值和活菌數相關系數最大（R2O78 = 0.991 2，R2CGM =0.990 4 ），相關程度最高，在此處依據OD值推測出的活菌數也更加接近實際活菌數。

通過分光光度法和活菌計數法在對數生長期求得的回歸方程，可以更加準確地推測出細菌在對數生長期的準確活菌數，避免了繁重的試驗步驟。

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