內源性一氧化碳對心肌缺血再灌注損傷的影響*

周 振，張 昱，紀巧榮，劉 杰，曹成珠，高 翔，張 偉

(青海大學高原醫學研究中心；青海省高原醫學應用基礎重點實驗室，青海 西寧 810001)

內源性一氧化碳對心肌缺血再灌注損傷的影響*

周 振，張 昱，紀巧榮，劉 杰，曹成珠，高 翔，張 偉△

(青海大學高原醫學研究中心；青海省高原醫學應用基礎重點實驗室，青海 西寧 810001)

目的 研究內源性一氧化碳對大鼠離體心臟心肌缺血再灌注損傷的影響。方法 大鼠經內源性一氧化碳激動藥物原卟啉氯化鈷(CoPP)處理后，采用Langendorff離體心臟灌流系統制作心肌缺血再灌注實驗模型，采集記錄離體心臟穩定期和缺血30 min再灌注時的左室收縮終末壓(LVESP)、左心室舒張終末壓(LVEDP)、心率(HR)、左室發展壓(LVDP)、左室最大收縮速率(+dP/dtmax)和左室最大舒張速率(-dP/dtmax)等心功能指標，探討內源性一氧化碳對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響。結果 在停灌前穩定期，對照組和藥物組心臟各項指標均保持平穩，兩組間指標無顯著性差異；停灌30 min后復灌，對照組較未停灌前心功能各項指標明顯下降，且變化較大，對心臟的舒縮功能影響較大，該組比停灌前LVESP下降了19.8%，+dP/dtmax下降了28.5%，-dP/dtmax的絕對值下降了33.6%，差異均具有顯著性(P<0.05)。而藥物組復灌后各項心功能指標變化較小，仍保持著停灌前的平穩水平，對心臟的舒縮功能影響較小，且復灌后達到穩定所用的時間較對照組明顯縮短(P<0.05)。結論 內源性一氧化碳對正常情況下心室的舒縮功能影響不大，但對心肌缺血再灌注損傷具有一定的保護作用。

內源性一氧化碳 缺血再灌注損傷 Langendoreff心臟離體灌流 心臟舒縮功能

一氧化碳(Carbon Monoxide，CO)被認為是一種能高度結合血紅蛋白從而使機體嚴重缺氧的高毒性物質[1]，然而近些年的研究發現，一氧化碳在體內又是一種重要的內源性氣體分子，調節著眾多生理和病理生理過程，并且在心血管系統、免疫系統以及中樞神經系統等許多系統中起著重要的作用。[2-3]體內的一氧化碳是血紅素氧合酶(Heme Oxygenase，HO)分解血紅素得到的產物，已經有許多研究發現血紅素通過血紅素氧和酶分解之后能產生許多對機體有益的物質[4]，內源性一氧化碳(Endogenous Carbon Monoxide)就是其中之一，其對于機體具有的保護作用也已被證實[5]，但對心肌發生的缺血再灌注損傷是否具有保護作用尚未證實。本研究利用Langendorff離體心臟灌流系統觀察內源性一氧化碳激動劑CoPP干預下心肌缺血再灌注損傷模型的各項心功能指標，探討內源性一氧化碳對心肌缺血再灌注損傷的影響，為心肌的缺血性保護提供有效依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用SPF級Wistar雄性成年大鼠，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號：SCXK(京)2012-0001，NO.11400700064575]。每組9只，體重251±9.4 g，大鼠置于23 ℃、晝/夜交替、自由采水和食物的條件下飼養。

1.2 實驗藥品和試劑

實驗用K-H液配制如下，NaCl 6.966 g/L，KCl 0.3653 g/L，CaCl20.2725 g/L，KH2PO40.1633 g/L，MgSO4·7H2O 0.2958 g/L，NaHCO32.1003 g/L，葡萄糖2.199 g/L，調節pH于7.3～7.4之間，藥品均購自Sigma公司，由超純水配制而成。麻醉劑選用烏拉坦(國藥集團化學試劑有限公司，批號T20090811)，用生理鹽水配制成20%的溶液，即配即用(0.08ml/100g)。原卟啉氯化鈷(CoPP)購自Sigma公司(C1900，MW：655.03)，用1N NaOH溶液溶解后稀鹽酸調至pH 7.4，再用生理鹽水稀釋到目標體積。

1.3 實驗儀器

選用澳大利亞AD公司Langendorff心臟灌流系統(AD Instrument，Australia)，包括Powerlab數據采集系統、壓力傳感器、蠕動泵、聚乙烯導管及乳膠球囊等全套裝備。

1.4 Langendorff離體心臟灌流模型

藥物組大鼠在實驗進行前24 h腹腔注射內源性一氧化碳的激動劑CoPP(5mg/kg)[6]，24 h后腹腔注射20%烏拉坦(40mg/kg，i.p)，開胸取出心臟，置于4 ℃ K-H液中，分離出升主動脈后清除干凈心臟內殘留血液，將灌注針固定到升主動脈后迅速懸掛固定于Langendorff離體灌注裝置上，持續通入95% O2和5% CO2混合氣體的K-H液行常規恒壓(40～60mmHg)灌流。剪開左心耳，將連接有壓力傳感器的心室球囊通過左心耳置入左心室，并將球囊內壓力維持在5～9 mmHg[7]，連接Powerlab信號采集器，采集記錄離體心臟左室收縮終末壓(1eft ventricularend-systolic pressure，LVESP)、左心室舒張終末壓(1eft ventricularend-diastolic pressure，LVEDP)、心率(heart rate，HR)、左室發展壓(1eft ventricular developed pressure，LVDP)、左室最大收縮速率(+dP/dtmax)和左室最大舒張速率(-dP/dtmax)[8]。

對照組取心臟前不做處理，麻醉后進行離體心臟灌注，步驟同上。

1.5 離體心臟缺血再灌注損傷模型

待心臟搏動穩定后記錄停灌前穩定期30 min各項數據，停止灌流30 min即刻復灌，待心臟恢復跳動記錄30 min的復灌后各項指標[9]。

1.6 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件，所有數據以均數±標準差表示，組間比較用t檢驗，組內不同時間點比較選用LSD法，灌注前后比較選用配對t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 離體心臟各時期心室生理學指標的變化情況(圖1～3，表1～3)

圖1 缺血再灌注時心室各生理學指標的變化描記圖
Figure 1 The representative recordings of the ventricular function index in ischemic reperfusion

圖2 停灌前各生理學指標的變化趨勢圖Figure 2 The summary of the changes in mean cardiac function index before ischemic reperfusion

圖3 復灌后各生理學指標的變化趨勢圖Figure 3 The summary of the changes in mean cardiac function index after ischemic reperfusion

表1 停灌前不同時間段各生理學指標的變化情況±s)Table 1 The changes in mean cardiac function index fromdifferenttimesbefore ischemic ±s)

續表：

表2 復灌后不同時間段各生理學指標的變化情況±s)Table 2 the changes in mean cardiac function index fromdifferenttimesafterischemic ±s)

*：表示與對照組比較，P<0.05；#：表示與起始點比較，P<0.05.

圖1～2和表1顯示，停灌前穩定期對照組和藥物組心臟LVESP、LVEDP、LVDP、左室±dP/dtmax變化趨勢一致，每一時間段之間差異不顯著，HR和FP始終保持穩定。

圖1、3和表2顯示，缺血再灌注后，對照組心臟各舒縮指標明顯下降，和停灌前相比LVESP下降了19.8%，+dP/dtmax下降了28.5%，-dP/dtmax的絕對值下降了33.6%，均有顯著性差異(P<0.05)，但隨時間的變化舒縮指標也呈現緩慢上升的趨勢，10 min后的上述指標較復灌起始點出現明顯差異(P<0.05)，HR波動較大，尤其在15 min后，差異顯著(P<0.05)，FP始終保持穩定、變化不明顯。與對照組相比，藥物組各項心臟指標在缺血再灌注前后相對平穩，能保持不變，尤其在缺血再灌注后心臟能保持較穩定的搏動狀態。

2.2 心臟生理學指標變化結果(表3)

表3 心臟在灌注前后各生理學指標的變化情況±s)Table 3 Changes in cardiac perfusion and reperfusion process in various physiological ±s)

▲：表示與對照組比較，P<0.05.

表3顯示，對照組停灌前后各項心臟功能指標均具有顯著差異(P<0.05)，而藥物組停灌前后各項指標沒有顯著性差異。與對照組相比，藥物組在停灌前后HR均較低，其他指標沒有顯著性差異；由于藥物組在缺血再灌注后各項心功能指標未出現明顯改變，所以與對照組相比，除FP外其他指標均有顯著性差異(P<0.05)；缺血再灌注后，對照組灌注壓明顯上升，說明缺血再灌注影響了對照組心臟的順應性。

2.3 復灌恢復穩定時間

在缺血再灌注損傷發生后，心肌或多或少地出現了功能上的障礙，而復灌后恢復穩定所需要的時間是衡量心臟受損的一個重要指標。與對照組相比，藥物組復灌恢復穩定時間為4.2±1.0 min，比對照組的8.1±1.4 min明顯縮短，差異有顯著性(t=4.26，P<0.05)，藥物組在復灌時能更快的進入穩定期。

3 討論

心肌缺血再灌注損傷是冠心病、溶栓治療，器官再植等疾病治療中常見的臨床現象，但是缺少有效治療和預防手段。內源性一氧化碳作為一種重要的氣體信號分子，可通過血紅素氧和酶-1產生，同時內源性一氧化碳還能減少細胞Ca2+內流，并且具有抗氧化活性[10]。故研究內源性一氧化碳和血紅素代謝產物是否對心肌缺血再灌注損傷起到保護作用具有重要的意義，也可為今后心肌缺血再灌注損傷的治療提供切實、有效的理論依據。

本實驗采用Langendorff離體心臟灌流系統建立心肌缺血再灌注模型，討論內源性一氧化碳對心肌缺血再灌注損傷的影響。其中，離體心臟灌流能使心臟脫離體內神經及體液因素的干擾，一方面能單純地反映藥物對心肌舒縮的直接影響，另一方面還能較好地反映心臟在受到缺血再灌注損傷后各個時段舒縮功能的變化[11]。因此，Langendorff灌流裝置能夠較好體現內源性一氧化碳對心肌缺血再灌注前后心臟舒縮功能的影響與調節作用，并且通過左心室放置的球囊能同步檢測心臟各項指標的變化情況。LVESP、±dP/dtmax、LVDP等是反映Langendorff離體心臟左心室舒縮功能的主要指標，這四項指標的數值高低反映了左心室的舒縮功能強弱，在發生心肌缺血再灌注之后，上述心功能指標的變化說明了心室舒縮功能受影響的高低[12]。

通過本次實驗結果可以看出，對照組和藥物組在缺血再灌注前穩定期的主要心臟功能指標沒有大的差異，說明內源性一氧化碳對正常情況下心室的舒縮功能影響較小，而在缺血再灌注后兩組之間的心臟舒縮功能發生了明顯的差異，對照組LVESP、±dP/dtmax和LVDP等心功能指標均下降，而藥物組仍然保持了停灌前的平穩水平，這說明內源性一氧化碳能維持穩定停灌后心臟舒縮功能，其對心肌的缺血再灌注損傷具有一定的保護作用。與此同時，對照組的FP在復灌后高于停灌注前的水平，這可能是由于心肌缺血再灌注損傷發生后影響了心臟內的微循環和組織結構，使得心臟的順應性降低、僵硬度增加，其FP升高勢必會影響心室的舒縮功能。另外，在復灌的最初階段，藥物組復灌穩定所需要的時間明顯低于對照組，這也可說明內源性的一氧化碳能保護停灌后處于缺血、缺氧的心肌組織，能較好地維持心臟的微循環和組織細胞，改善心臟的組織結構和順應性，表現出復灌后心臟舒縮功能的快速恢復和FP的穩定。

本研究應用了內源性一氧化碳激動劑CoPP，這種藥物可以促進HO-1分解血紅素產生一氧化碳，從而使得體內內源性一氧化碳含量增加，尤其是在肝臟和心臟[13]等血液供應充足的器官。通過實驗結果可以看出，使用內源性一氧化碳激動劑的大鼠離體心臟舒縮功能均可保持在一個相對穩定的狀態，即使發生缺血再灌注損傷后仍保持了停灌前的穩定狀態，無論是停灌前還是復灌后，藥物組心臟的舒縮功能指標始終保持在一個較平穩的水平，這可能與內源性一氧化碳能降低心肌細胞Ca2+內流、減少鈣超載等作用[14]有關。另外，藥物組停灌前后的HR雖保持平穩，但始終低于對照組，這也可能是因為內源性一氧化碳可通過心肌細胞內Ca2+的減少[15]使心室舒張延緩；而對照組在復灌后心率升高，這說明心肌在發生缺血再灌注損傷后出現了心肌細胞的鈣超載。心肌細胞短時間內一定濃度的Ca2+異常增多，會使心臟二期平臺期縮短，從而使心動周期縮短、心率加快[16]。這也說明了增加體內內源性的一氧化碳對心肌缺血再灌注損傷具有一定的保護作用。

綜上所述，一氧化碳作為一種內源性氣體分子，除了調節正常的生理活動外，其對心臟缺血性疾病可能具有至關重要的臨床作用。通過內源性一氧化碳激動劑CoPP增加內源性一氧化碳，能對心臟的收縮功能起到維持穩定的作用，其具體的保護機制還需要進一步的研究闡明。

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The effect of endogenous carbon monoxide on myocardial ischemia reperfusion injury*

ZHOU Zhen，ZHANG Yu，JI Qiao-rong，LUI Jie，CAO Cheng-zhu，GAO Xiang，ZHANG Wei△

(High altitude medical research center of Qinghai University； The Key Laboratory of high altitude medical application of Qinghai Province，Xining，Qinghai 810001)

Objective To explore the effect endogenous carbon monoxide on myocardial ischemia reperfusion injuryafter Cobalt Protoporphyrin(CoPP)treatment.Method The rats were treated with CoPP(Agonist of endogenous carbon monoxide).The myocardial ischemia reperfusion model was established by Langendorff isolated cardiac perfusion system.The 1eft ventricular systolicpressure(LVESP)，1eft ventricular end-diastolic pressure(LVEDP)，1eft ventricular developed pressure(LVDP)，the maximum rate of left ventricular pressure(±dP/dtmax)were obtained.Result Before reperfusion，all parameters remained stable in control group and CoPP group，and no significant difference between the two groups.After reperfusion，the control group’s cardiac function decreased significantly(P<0.05)，the LVESP decreased 19%，+dP/dtmaxdecreased 28.5% and -dP/dtmaxdecreased 33.6%.Compared with the control group，the CoPP group’s cardiac function did not change significantly，while still maintaining a relatively stable level.Conclusion The endogenous carbon monoxide has no effect on normal cardiac function，but it has positive effect on the cardiac abnormaldiastolic and systolic function，that protect the cardiac function from myocardial ischemia reperfusion injury.

Endogenous carbon monoxide Ischemia reperfusion injury Langendorff isolated cardiac perfusion system Cardiac diastolic and systolic function

*：國家自然基金項目(81560301；81160012)；教育部新世紀優秀人才項目(NCET-12-1022)；△：通信作者，博導，教授，zw0228@sina.com 周振(1991～)，男，漢族，陜西籍，碩士研究生；

R363

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.01.006

2017-02-20